複数の遺伝子欠失を持つ酵母菌株の世代のためのグリーンモンスタープロセス
Summary
グリーンモンスターメソッドは、緑色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子でマークされた複数の削除を迅速に組み立てることができます。このメソッドは、性的失の品揃えや、その他の欠失を保有する細胞の蛍光ベースの濃縮の繰り返しサイクルを通して酵母菌株を駆動に基づいています。
Abstract
遺伝子欠失のための表現型は、しばしば突然変異が特定の遺伝的背景や環境条件1,2でテストされているときにのみ明らかにされています。多くの遺伝子が隠された遺伝子の機能3,4のマスクを解除するために削除する必要がある例があります。重要な発見の可能性にもかかわらず、3つ以上の遺伝子が関与する遺伝的相互作用は、主に未踏されています。マルチ変異体の相互作用の網羅的な検索が欠失の可能な組み合わせの膨大な数のために現実的ではありません。しかし、このような共通機能を共有することの大きいアプリオリの確率でパラログのセットなどの遺伝子の選択セットの研究は、有益であろう。
酵母 Saccharomyces cerevisiaeにおいて、遺伝子ノックアウトは、相同組換えを介した選択マーカーと遺伝子を交換することによって達成されます。マーカーの数が限られているので、このメソッドでは、SAMを削除し、再利用のために開発されている電子マーカー5,6,7,8,9,10。時間が生成される削除の数に比例して直線的に必要なので、これらのメソッドを使用して順次工学複数の変異は時間がかかります。
ここでは、日常的に酵母11に複数の削除を工学のためのグリーンモンスター方法を説明します。この方法では、削除に統合された緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターが定量的に各菌株に含まれる削除の数（ 図1）に記載の菌株にラベルを付けるために使用されています。これらの欠失の多くを運ぶ株のフローサイトメトリー濃縮と相まって酵母の接合と減数分裂を経由して、GFP-著しい失の品揃えの繰り返しラウンドは株の欠失（ 図2）の蓄積につながる。各プロセスがラウンドごとに1つ以上の欠失を組み込むとともに、並行して複数のプロセスを実行し、ひずみ建設に必要な時間が短縮されます。
GFPの削除された遺伝子座でのレポーターや"ツールキット"座·どちらグリーンモンスターGMToolkitまたは少なくともGMToolkit-αの1を運びそれぞれのコンテンツは、 ">と呼ばれる最初のステップは、半数体、単変異体を作製することは'ProMonsters、' can1Δ軌跡（ 図3）酵母削除コレクション12から菌株を用い、GFP顕著な欠失が便利なユニバーサルGFPでこれらの株に存在する共通のKanMX4カセット交換することによって生成することができます- URA3断片を各GMToolkitが含まれています。どちらか-またはα接合型特異半数体選択マーカー1とその2つのマーカーのちょうど1つ、両方GMToolkitsが存在する場合に、一括して二倍体の選択を可能にする。第二段階は、欠失遺伝子座がランダムな組み合わせ、および/または減数recombにより単一細胞内で組み合わせることができるような性的サイクリングを実施することである交配と胞子形成の各サイクルを伴うもののみ。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々はグリーンモンスターアプローチを開発したように、我々は、ゲノム再編成につながる、異なるGFPの交換カセット間の組換えの可能性に関心を持っていた。このような事態を軽減することに成功交配と減数分裂の複数のラウンドを受けた細胞のための私達の選択である。再配列ゲノムを持つ細胞は、同一の再調整なしに細胞に交配後少なくフィットすることが期待されています。実際、?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品はFPRFPRにYSは、RSLにアルフレッド·P·スローン財団からの助成金、そして健康の助成金は、米国国立衛生研究所R01 HG003224とR21 CA130266に米国国防総省の国防高等研究計画庁契約N66001-12-C-4039でサポートされていたことだったまた、先端研究のためのカナダの研究所からの交わりによっておよびカナダの優秀研究チェアプログラムでサポートされている。
Materials
| Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| G418 | Sigma-Aldrich | A1720 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 200 mg/ml. Store at 4 °C. |
| ClonNAT (nourseothricin) | WERNER BioAgents | 5001000 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 100 mg/ml. Store at 4 °C. |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Dissolve in 50% ethanol and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 10 mg/ml. Make fresh every four weeks. Shield from light using aluminum foil and store at 4 °C. |
| Zymolyase | ZymoResearch | E1005 | |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291940 | |
| Revolver (rotator for tubes) | Labnet | H5600 | |
| Enduro Gel XL electrophoresis unit | Labnet | E0160 | |
| Sonifier 450 | Branson | 101-063-198 | |
| Microtip for Sonifier 450 | Branson | 101-148-062 | |
| FACSAria cell sorter | BD | ||
| MoFlo cell sorter | Beckman-Coulter | ||
| Biomek FX or equivalent robot | Beckman Coulter | Optional. For setting up genotyping PCRs. |
Riferimenti
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