O Processo de monstro verde para a Geração de linhagens de levedura de transporte deleções de genes múltiplos
Summary
O método permite que o monstro verde montagem rápida de exclusões múltiplas marcados com um gene que codifica a proteína verde fluorescente repórter. Este método baseia-se em estirpes de levedura de condução através de ciclos repetidos de sortimento sexual de deleções e fluorescência baseada enriquecimento de células que transportem mais deleções.
Abstract
Fenótipos de uma deleção do gene são frequentemente revela apenas quando a mutação é testado em um fundo genético particular ou 1,2 condição ambiental. Há exemplos em que muitos genes precisam ser apagados para desmascarar funções de genes ocultos 3,4. Apesar do potencial de descobertas importantes, interações genéticas envolvendo três ou mais genes são largamente inexplorado. Buscas exaustivas de multi-mutantes interações seria inviável devido ao grande número de combinações possíveis de exclusões. No entanto, os estudos de conjuntos de genes seleccionados, tais como conjuntos de parálogos com maior probabilidade a priori de uma partilha uma função comum, seria informativo.
Na levedura Saccharomyces cerevisiae, knockout do gene é realizada por substituição de um gene com um marcador seleccionável através de recombinação homóloga. Devido ao número de marcadores é limitada, foram desenvolvidos métodos para a remoção e reutilização do sam e marcador 5,6,7,8,9,10. No entanto, as mutações de engenharia sequencialmente múltiplas usando esses métodos é demorado porque o tempo necessário escalas linearmente com o número de deleções a ser gerado.
Aqui descrevemos o método monstro verde para rotineiramente a engenharia de exclusões múltiplas na levedura 11. Neste método, a proteína verde fluorescente repórter (GFP) integrado deleções é usado para estirpes quantitativamente etiquetas de acordo com o número de deleções contidos em cada estirpe (Figura 1). Ciclos repetidos de sortimento de GFP-marcados através de deleções de acasalamento de levedura e meiose acoplado com fluxo de citometria de enriquecimento de estirpes que transportem mais dessas supressões levar à acumulação de deleções em estirpes (Figura 2). Realizando vários processos em paralelo, com cada processo de incorporação de um ou mais deleções por rodada, reduz o tempo necessário para a construção da estirpe.
conteúdo "> O primeiro passo consiste em preparar um único mutantes haplóides denominado« ProMonsters ', cada um dos quais transporta um repórter GFP em um locus suprimido e um dos "kit de ferramentas" loci-ou-GMToolkit um monstro verde ou GMToolkit-α no . can1Δ locus (Figura 3) usando as estirpes de levedura a supressão recolha 12, GFP marcadas deleções pode ser convenientemente gerado pela substituição da cassete KanMX4 comum existente nessas estirpes com uma GFP universal – URA3 Cada fragmento GMToolkit contém:. quer a um – ou α-acasalamento tipo específico de marca de selecção haplóide 1 e exatamente um dos dois marcadores que, quando ambos estão presentes GMToolkits, coletivamente permitem a selecção de diplóides.O segundo passo é fazer o ciclo sexual por meio do qual loci deleção podem ser combinados dentro de uma única célula, a distribuição aleatória e / ou recomb meióticaminação que acompanha cada ciclo de acasalamento e esporulação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como se desenvolveu a abordagem monstro verde, estávamos preocupados com a possibilidade de recombinação entre cassetes de substituição diferentes GFP, levando ao rearranjo do genoma. Mitigação contra esta possibilidade é a nossa seleção para as células que resistiram várias rodadas de acasalamento e meiose. Células portadoras de genomas rearranjados se espera que sejam menos aptos após o acasalamento para células sem um rearranjo idênticos. Na verdade, não observamos qualquer instabilidade do genoma re…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Defense Advanced Research Projects Agency EUA contrato N66001-12-C-4039 a YS, uma bolsa da Fundação Alfred P. Sloan para RSL, e Nacional dos EUA Institutos de bolsas de Saúde HG003224 R01 e R21 CA130266 para FPRFPR foi também apoiado por uma bolsa de estudos do Instituto Canadense de Pesquisas Avançadas e pelo programa de Excelência de Pesquisa do Canadá Cadeiras.
Materials
| Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| G418 | Sigma-Aldrich | A1720 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 200 mg/ml. Store at 4 °C. |
| ClonNAT (nourseothricin) | WERNER BioAgents | 5001000 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 100 mg/ml. Store at 4 °C. |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Dissolve in 50% ethanol and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 10 mg/ml. Make fresh every four weeks. Shield from light using aluminum foil and store at 4 °C. |
| Zymolyase | ZymoResearch | E1005 | |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291940 | |
| Revolver (rotator for tubes) | Labnet | H5600 | |
| Enduro Gel XL electrophoresis unit | Labnet | E0160 | |
| Sonifier 450 | Branson | 101-063-198 | |
| Microtip for Sonifier 450 | Branson | 101-148-062 | |
| FACSAria cell sorter | BD | ||
| MoFlo cell sorter | Beckman-Coulter | ||
| Biomek FX or equivalent robot | Beckman Coulter | Optional. For setting up genotyping PCRs. |
Riferimenti
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