The Green Monster Werkwijze voor de generatie van giststammen dragen Meerdere gendeleties
Summary
De Green Monster methode kan de snelle montage van meerdere deleties gemarkeerd met een reportergen codeert groen fluorescent eiwit. Deze methode is gebaseerd op een giststammen door herhaalde cycli van seksuele assortiment van deleties en fluorescentie gebaseerde verrijking van cellen die meer deleties.
Abstract
Fenotypes voor gendeletie vaak onthuld wanneer de mutatie getest in een bepaalde genetische achtergrond of omgevingsconditie 1,2. Er zijn voorbeelden waar veel genen moeten worden verwijderd om te ontmaskeren verborgen genfuncties 3,4. Ondanks het potentieel voor belangrijke ontdekkingen, zijn genetische interacties met drie of meer genen grotendeels onontgonnen. Uitputtende zoekopdrachten van multi-mutant interacties zou onpraktisch zijn als gevolg van het grote aantal mogelijke combinaties van verwijderingen. Zou echter studies van geselecteerde sets van genen, zoals sets van paralogen met meer a priori kans van een gemeenschappelijke functie informatief.
In de gist Saccharomyces cerevisiae is knockout bewerkstelligd door vervanging van een gen met een selecteerbare merker via homologe recombinatie. Omdat het aantal markers beperkt zijn werkwijzen ontwikkeld voor het verwijderen en opnieuw de sam e marker 5,6,7,8,9,10. Echter achtereenvolgens techniek meerdere mutaties met deze methoden is tijdrovend omdat de tijdschalen lineair vereist met het aantal deleties te genereren.
Hier beschrijven we de Green Monster methode voor routinematig engineering van meerdere deleties in gist 11. In deze methode wordt een groen fluorescerend eiwit (GFP) reporter geïntegreerd in deleties gebruikt om kwantitatief label stammen volgens het aantal deleties in elke stam (figuur 1). Herhaalde rondes van het assortiment van GFP-gemerkt deleties via gist mating en meiose gekoppeld met flow-cytometrische verrijking van stammen die meer van deze deleties leiden tot de ophoping van deleties in stammen (figuur 2). Het uitvoeren van meerdere processen in parallel met elk proces waarin een of meer deleties per ronde minder tijd nodig voor stam constructie.
inhoud "> De eerste stap is de voorbereiding van haploïde single-mutanten genoemd 'ProMonsters,' die elk draagt een GFP reporter in een verwijderde locus en een van de 'toolkit' loci-ofwel Green Monster GMToolkit-a of GMToolkit-α in de . can1Δ locus (Figuur 3) Gebruik stammen van de gist deletie collectie 12 kan GFP-gemerkte deleties eenvoudig worden gegenereerd door het vervangen van de gemeenschappelijke KanMX4 cassette bestaande in deze stammen met een universele GFP – URA3 fragment Elke GMToolkit bevat:. hetzij de a – of α-mating-type-specifieke haploïde selectiemerker 1 en precies een van de twee markers die, wanneer beide GMToolkits aanwezig zijn, samen zorgen voor selectie van diploïde.De tweede stap is het uitvoeren van de seksuele fietsen waardoor deletie loci kunnen in een cel worden gecombineerd door de willekeurige sortering en / of meiotische Recombination dat elke cyclus van de paring en sporulatie begeleidt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij het ontwikkelen van de Green Monster benadering zijn we bezig met de mogelijkheid van recombinatie tussen verschillende GFP vervangen cassettes, waardoor genoom omlegging. Verzachten tegen deze mogelijkheid is onze selectie voor cellen die succes hebben ondergaan meerdere ronden van paring en meiose. Cellen die herschikt genomen naar verwachting minder geschikt na koppeling met een identieke cellen zonder omlegging. Inderdaad, we hebben niet in acht te nemen genoom instabiliteit als gevolg van recombinatie tussen GF…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de US Defense Advanced Research Projects Agency contract N66001-12-C-4039 aan YS, een subsidie van de Alfred P. Sloan Foundation om RSL, en de Amerikaanse National Institutes of Health subsidies R01 HG003224 en R21 CA130266 te FPRFPR was ook ondersteund door een beurs van de Canadese Institute for Advanced Research en door de Canada Excellence Research Chairs programma.
Materials
| Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| G418 | Sigma-Aldrich | A1720 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 200 mg/ml. Store at 4 °C. |
| ClonNAT (nourseothricin) | WERNER BioAgents | 5001000 | Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 100 mg/ml. Store at 4 °C. |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Dissolve in 50% ethanol and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 10 mg/ml. Make fresh every four weeks. Shield from light using aluminum foil and store at 4 °C. |
| Zymolyase | ZymoResearch | E1005 | |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291940 | |
| Revolver (rotator for tubes) | Labnet | H5600 | |
| Enduro Gel XL electrophoresis unit | Labnet | E0160 | |
| Sonifier 450 | Branson | 101-063-198 | |
| Microtip for Sonifier 450 | Branson | 101-148-062 | |
| FACSAria cell sorter | BD | ||
| MoFlo cell sorter | Beckman-Coulter | ||
| Biomek FX or equivalent robot | Beckman Coulter | Optional. For setting up genotyping PCRs. |
Riferimenti
- Tong, A. H., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science’s STKE. 294, 2364-23 (2001).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
- Beh, C. T., Cool, L., Phillips, J., Rine, J. Overlapping functions of the yeast oxysterol-binding protein homologues. Genetica. 157, 1117 (2001).
- Wieczorke, R., et al. Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae. FEBS letters. 464, 123-128 (1999).
- Alani, E., Cao, L., Kleckner, N. A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains. Genetica. 116, 541-545 (1987).
- Akada, R., et al. PCR-mediated seamless gene deletion and marker recycling in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 399-405 (2006).
- Guldener, U., Heck, S., Fielder, T., Beinhauer, J., Hegemann, J. H. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic acids research. 24, 2519 (1996).
- Delneri, D., et al. Exploring redundancy in the yeast genome: an improved strategy for use of the cre-loxP system. Gene. 252, 127-135 (2000).
- Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nat. Biotech. 19, 773-776 (2001).
- Noskov, V. N., Segall-Shapiro, T. H., Chuang, R. Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage (TREC): a seamless modification tool for genome engineering in yeast. Nucl. Acids Res. 38, 2570-2576 (2010).
- Suzuki, Y., et al. Knocking out multigene redundancies via cycles of sexual assortment and fluorescence selection. Nat. Methods. 8, 159-164 (2011).
- Winzeler, E. A. Functional Characterization of the S. Genome by Gene Deletion and Parallel Analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
- Woods, R. A., Gietz, R. D. High-efficiency transformation of plasmid DNA into yeast. Methods Mol. Biol. 177, 85-97 (2001).
- Hughes, T. R., et al. Widespread aneuploidy revealed by DNA microarray expression profiling. Nature. 25, 333-337 (2000).
- Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15, 1541-1553 (1999).
- Newman, J. R. S., et al. Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441, 840-846 (2006).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962 (2005).
