Analyse av encellede gentranskripsjon av RNA Fluorescent<em> In Situ</em> Hybridisering (FISH)

Summary

Fluoriserende<em> In situ</em> Hybridisering (FISH) til å identifisere mRNA transkripsjoner i enkeltceller tillater analyse av polygenisk aktivitet som samtidig transkripsjon av mer enn ett medlem av<em> Var</em> Multigene familie i<em> Plasmodium falciparum</em> Infiserte erytrocytter¹. Teknikken er tilpasningsdyktig og kan brukes på forskjellige typer gener, celler og organismer.

Abstract

Heft Plasmodium falciparum infiserte erytrocytter (IE) til humane endotelceller reseptorer under malaria infeksjoner er mediert av uttrykk for PfEMP1 protein varianter kodet av VAR gener.

Den haploid P. falciparum genom havner omtrent 60 forskjellige VaR gener hvorav kun ett er antas å bli transkribert per celle om gangen under blod stadium av infeksjonen. Hvordan et slikt gjensidig utelukkende regulering av Var gentranskripsjon oppnås er uklart, er som identifisering av individuelle VAR gener eller undergrupper av Var gener assosiert med ulike reseptorer og konsekvensen av differensial binding på den kliniske utfallet av P. falciparum infeksjoner. Nylig har gjensidig utelukkende transkripsjon paradigme blitt kalt inn tvil ved transkripsjon analyser basert på individuelle P. falciparum karakterutskrift identifikasjon i ett infected erythrocytic celler ved hjelp av RNA fluorescerende in situ hybridisering (FISH) analyse av Var gentranskripsjon av parasitten i enkelte kjerner av P. falciparum IE ^en.

Her presenterer vi en detaljert protokoll for gjennomføring av RNA-FISH metodikk for analyse av Var gentranskripsjon i single-kjerner av P. falciparum smittet humane erytrocytter. Metoden er basert på bruk av Digoxigenin-og biotin-merket antisens RNA sonder bruker TSA Plus Fluorescence Palette System ² (Perkin Elmer), mikroskopiske analyser og ferskt valgt P. falciparum IE. In situ hybridisering metoden kan brukes til å overvåke transkripsjon og regulering av en rekke gener som skal uttrykkes under de forskjellige stadier av P. falciparum livssyklus og er tilpasningsdyktig til andre malariaparasitten arter og andre organismer og celletyper.

Protocol

1. Generasjon Fersk Utvalgte Infiserte Erytrocytter For denne analysen, blir de beste resultater oppnådd ved bruk av ferskt utvalgte kulturer for overflate ekspresjon av PfEMP1 protein. I dette spesielle forsøket 3D7 P. falciparum avstamning ble valgt ved hjelp av spesifikke antistoffer som tidligere beskrevet 1. Dag 1 Innhøsting 200fil av pakkede blodlegemer fra en P. falciparum kultur inneholdende 2-5% sent stadium IE ved…

Representative Results

Figur 1 illustrerer et flytskjema av de store trinn og varigheten av RNA FISH metodikk. En rekke representative bilder av godt og dårlig bevarte farget mRNA FISK forsøk med én P. falciparum IE er vist i figur 2. Dette intracellulære protozo har en liten (1-1,5 mikrometer diameter) kjerne som er farget blå med DAPI. Fire tyve timer etter erytrocytt invasjon i P. falciparum prosessen schizogony, dvs. kjernefysisk inndeling, begy…

Discussion

RNA FISH analyse, i motsetning til metoder som Northern blotting og RT-PCR, tillater diskriminering av spesifikke mRNA transkripter på enkelt celle-nivå. Dette gjør det mulig å diskriminere mellom transkripsjonelt aktive og inaktive celler, i dette eksemplet, P. falciparum parasittiske protozoer inne humane røde blodceller. Slike hel-celle observasjoner er ofte nødvendig, og kan rakne viktige og romanen transkripsjonelle mønstre ^en.

Selv om andre RNA FISH metoder h…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Acetic Acid	Sigma/Aldrich	338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution	Lonza	BE02-012E	2.5 ml gentamycin sulphate 50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II	Invitrogen	11021-037	200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 liter RPMI 1640 Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite	Sigma	A5710-110G	Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate	Calbiochem	203206
Anti-Dig antibody	Novus biologicals	NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI	Invitrogen	P36931	The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix	Roche	11685597910
Camera digital	Nikon digital sight DC-F11
Coverslips	Menzel-glaser	631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface	Nunc	156340
DEPC	Fluka/Sigma	32490-100ml	1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera	Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A	Invitrogen	10002D
DynaMaq-15 Magnet	Invitrogen	123-01D
Formamide bioultra 99 %	Fluka/Sigma	47671-1l-F	Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine	Sigma-Aldrich	G2500	3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin	Sigma-Aldrich	G3126	14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl	Sigma	H1758	14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x	Fluka/Sigma	47671-1l-F	Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots 10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt’s 50x concentrate	Sigma	D2532	5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent	Sigma	R-6750	2 ml 50x Denhardt’s 250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA	Fluka/Sigma	31149-106GF	0.4 g Roche blocking reagent 1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free	Sigma	10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope	Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish	Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl KCl Na2HPO4 x 2H2O KH2PO4 DEPC deionized H2O			Ajust pH to 7.4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l
Paraformaldehyde 4 %	Fluka/chemika	76240	4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 %			950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin	Sigma/Aldrich	P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin	Calbiochem	203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution	Lonza	BE12-115F	500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate	Lonza	BE02-012E	2.5 ml gentamycin sulphate
RNase	Sigma/Aldrich		Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube	Ambion	AM12450
RNase Zap	Ambion	AM9780
Slides 4 wells 11 mm	Thermo Scientific	MENZXER306W
SSC 20x: NaCl	Sigma/Aldrich	S9625	3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate	Sigma/aldrich	W302600	3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl	Sigma/Aldrich	S9625	175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4	Sigma/Aldrich	S0751	27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder			9.4 g EDTA powder Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer			10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent			0.05 g Blocking reagent To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl	Sigma	T1503	1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 ml
TNT buffer: Tween20	Sigma	93773	5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O 869 Ml Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile	Almeco – CM LAB Aps	91016