प्रतिकृति और बीटा सेल समारोह का आकलन Adenovirally transduced पृथक कृंतक Islets
Summary
यह प्रोटोकॉल का एक कारक है कि कार्यात्मक बीटा सेल जन व्यवस्थित करने के लिए मधुमेह के उपचार के लिए संभावित चिकित्सात्मक लक्ष्य की पहचान करने की अनुमति देता है. प्रोटोकॉल अलग चूहा adenoviruses साथ जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर के बाद islets में आइलेट प्रतिकृति और बीटा सेल समारोह का आकलन करने के लिए एक सुव्यवस्थित विधि के होते हैं.
Abstract
ग्लूकोज homeostasis को मुख्य रूप से अंत: स्रावी हार्मोन इंसुलिन और ग्लूकागन द्वारा नियंत्रित किया जाता है, अग्नाशय बीटा और अल्फा कोशिकाओं से स्रावित, क्रमशः. कार्यात्मक बीटा सेल जन संरचनात्मक बीटा सेल के रूप में अच्छी तरह के रूप में बीटा कोशिकाओं की क्षमता के लिए एक पोषक तत्व लोड करने के लिए जवाब जन द्वारा निर्धारित किया जाता है. कार्यात्मक बीटा सेल जन नुकसान मधुमेह 1-3 की दोनों प्रमुख रूपों के लिए केंद्रीय है. जबकि कार्यात्मक गिरावट टाइप 1 मधुमेह एक autoimmune हमले से बीटा सेल जन परिणाम, टाइप 2 मधुमेह में, इस घटती दोनों बीटा कोशिकाओं की अक्षमता इंसुलिन छिपाना उचित और तंत्र की एक काडर से बीटा कोशिकाओं के विनाश से विकसित करता है. इस प्रकार, कार्यात्मक बीटा सेल जन को बहाल करने के प्रयासों के बेहतर उपचार और मधुमेह के लिए संभावित इलाज के लिए सर्वोपरि हैं.
आणविक मार्ग है कि प्रतिकृति को प्रोत्साहित करने के लिए और बीटा कोशिकाओं के समारोह बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की पहचान के प्रयास चल रहे हैं.आदर्श रूप में, चिकित्सकीय लक्ष्य दोनों बीटा सेल के विकास और समारोह में सुधार होगा. शायद अधिक महत्वपूर्ण है यद्यपि की पहचान है कि एक रणनीति है कि बीटा सेल विकास को बढ़ावा देने आई. बीटा सेल समारोह (जैसे कुछ ओंकोजीन के साथ) और इसके विपरीत की कीमत पर आता है.
व्यवस्थित दबा या overexpressing अलग चूहा islets में लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के द्वारा, एक बढ़ती कार्यात्मक बीटा सेल 4-6 बड़े पैमाने के लिए संभावित चिकित्सात्मक लक्ष्यों की पहचान कर सकते हैं. Adenoviral वैक्टर अलग चूहा 4,7-15 टापू में कुशलतापूर्वक overexpress या पछाड़ना प्रोटीन के लिए नियोजित किया जा सकता है. यहाँ, हम करने के लिए एक जीन अभिव्यक्ति का उपयोग adenoviral पारगमन में हेरफेर और आइलेट और अलग चूहा टापू (चित्रा 1) में बीटा सेल समारोह प्रतिकृति का आकलन विधि प्रस्तुत करते हैं. इस विधि में पहले से इस्तेमाल किया गया है उपन्यास लक्ष्य है कि बीटा सेल प्रतिकृति या 5,6,8,9,16,17 समारोह मिलाना की पहचान.
Protocol
Discussion
रास्ते की स्थापना है कि प्रतिकृति को प्रोत्साहित करने के लिए और बीटा कोशिकाओं के समारोह बढ़ाने के लिए modulated किया जा सकता है मधुमेह के दोनों प्रमुख रूपों के लिए प्रासंगिक हैं. क्योंकि कार्यात्मक बीटा से?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एनआईएच (PTF करने के लिए) से इस काम DK078732 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR |
Riferimenti
- Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
- Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E. The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 104, 787-794 (1999).
- Keenan, H. A. Residual insulin production and pancreatic ss-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist Study. Diabetes. 59, 2846-2853 (2010).
- Bain, J. R., Schisler, J. C., Takeuchi, K., Newgard, C. B., Becker, T. C. An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans. Diabetes. 53, 2190-2194 (2004).
- Fueger, P. T. Trefoil factor 3 stimulates human and rodent pancreatic islet beta-cell replication with retention of function. Mol. Endocrinol. 22, 1251-1259 (2008).
- Schisler, J. C. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol. Cell Biol. 28, 3465-3476 (2008).
- Chan, C. B. Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets. Diabetes. 48, 1482-1486 (1999).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53, 149-159 (2004).
- Icyuz, M. Adenovirus infection activates akt1 and induces cell proliferation in pancreatic islets1. Transplantation. 87, 821-824 (2009).
- Kaneto, H. Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress. J. Biol. Chem. 276, 31099-31104 (2001).
- Antinozzi, P. A., Berman, H. K., O’Doherty, R. M., Newgard, C. B. Metabolic engineering with recombinant adenoviruses. Annu. Rev. Nutr. 19, 511-544 (1999).
- Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O’Doherty, R. M. Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells. Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).
- Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels. J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).
- Csete, M. E. Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function. Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).
- Csete, M. E. Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors. Transplantation. 59, 263-268 (1995).
- Meng, Z. X. Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest. Diabetologia. 52, 125-135 (2009).
- Ronnebaum, S. M. A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion. J. Biol. Chem. , (2006).
- Milburn, J. L. Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids. J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).
- Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. Murine Pancreatic Islet Isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
