La evaluación de la replicación y la función celular beta en Adenovirally transducidas aislados islotes de roedores

Summary

Este protocolo permite a uno identificar los factores que modulan la masa funcional de las células beta para encontrar posibles dianas terapéuticas para el tratamiento de la diabetes. El protocolo consiste en un método simplificado para evaluar la replicación de islotes y la función de las células beta en los islotes de rata aislados siguientes manipulación de la expresión génica con adenovirus.

Abstract

Homeostasis de la glucosa se controla principalmente por la insulina y glucagon endocrino hormonas, secretada por la beta del páncreas y las células alfa, respectivamente. Masa funcional de las células beta está determinada por la masa de células beta anatómica, así como la capacidad de las células beta para responder a una carga de nutrientes. Una pérdida de masa funcional de las células beta es fundamental para ambas formas principales de diabetes ^1-3. Considerando que los resultados la disminución de masa de células beta funcionales de un ataque autoinmune en la diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, este decremento se desarrolla a partir tanto de la incapacidad de las células beta que segregan la insulina de manera adecuada y la destrucción de las células beta de un grupo de mecanismos. Por lo tanto, los esfuerzos para restaurar la masa funcional de las células beta son fundamentales para el tratamiento y la mejor de las curas potenciales para la diabetes.

Se están realizando esfuerzos para identificar las vías moleculares que pueden ser aprovechados para estimular la replicación y mejorar la función de las células beta.Idealmente, los objetivos terapéuticos que mejoraría tanto el crecimiento de las células beta y su función. Quizás lo más importante es sin embargo para identificar si una estrategia que estimula el crecimiento de las células beta es a costa de perjudicar la función de las células beta (por ejemplo, con algunos oncogenes) y viceversa.

En forma sistemática supresión o la sobreexpresión de la expresión de los genes diana en islotes aislados de rata, se puede identificar posibles dianas terapéuticas para el aumento de la masa funcional de las células beta ^6.4. Los vectores adenovirales pueden ser empleados para las proteínas eficientemente sobreexpresan o desmontables en los islotes de rata aislados ^4,7-15. A continuación, presentamos un método para manipular la expresión génica utilizando transducción adenoviral y evaluar la replicación del islote y la función de células beta en los islotes aislados de rata (Figura 1). Este método ha sido utilizado anteriormente para identificar nuevos objetivos que modulan la replicación de las células beta o de la función ^{5,6,8,9,16,17.}

Protocol

1. Transducción adenoviral y el cultivo de islotes de rata Preparar un 6-así no tejido recubierto con placa de cultivo mediante la adición de 2 ml de medio (RPMI 1640 que contienen 8 mM de glucosa, 10% de suero fetal bovino, 50 unidades / ml de penicilina, y 50 ug / ml de estreptomicina) para el número requerido de pozos. Por ejemplo, un experimento típico puede requerir tres pozos, uno cada uno para un control sin virus, un control de virus (por ejemplo, GFP-expresión de adenovirus), y el grupo experim…

Discussion

El establecimiento de las vías que pueden ser moduladas para estimular la replicación y mejorar la función de las células beta son relevantes para las dos formas principales de diabetes. Debido a que la masa de células beta funcionales depende de la existencia y función de las células secretoras de insulina, la evaluación de estos factores determinantes al mismo tiempo tiene sus ventajas. Este protocolo se describe un protocolo simplificado para determinar si la sobreexpresión o la supresión de una proteína c…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
RPMI 1640 media	Gibco	11879
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140
6-well plate	BD-Falcon	35-1146	Non-TC treated
[methyl-3H]-thymidine	Perkin Elmer	NET027Z001MC	1 mCi/ml
Micro-centrifuge tubes	Denville	C2170	1.7 ml
NaCl	Sigma	59888
KCl	Acros	42409
KH2PO4	Acros	20592
MgSO4	Acros	41348
CaCl2	Acros	34961
HEPES	Sigma	H0887	1 M solution
35% BSA	Sigma	A7979
NaHCO3	Acros	42427
d-glucose	Sigma	G8769
TCA	Fisher Scientific	SA9410-1	10% w/v
NaOH	Acros	12426
Scintillation counting tube	Sarstedt	58.536	7 ml, PP
Scintillation counting tube cap	Sarstedt	65.816
Econo-Safe counting cocktail	RPI	111175
Insulin RIA	Siemens	TKIN2
BCA Assay Kit	Thermo Scientific	23250
			Equipment
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Scintillation counting tube rack	Sarstedt	93.1431.001
Liquid scintillation counter	Perkin Elmer	Tri-Carb 2910TR