Vurdering Replication og betacellefunktionen i adenoviralt-transducerede Isolerede gnavere holme
Summary
Denne protokol tillader en at identificere faktorer, der modulerer funktionelle beta-cellemasse til at finde potentielle terapeutiske mål for behandling af diabetes. Den protokol består af en strømlinet metode til at vurdere islet replikation og beta celle funktion i isolerede rotte-øvævsceller efter manipulering af genekspression med adenovirus.
Abstract
Glucosehomeostase styres primært af endokrine hormoner insulin og glucagon, secerneres fra pancreas-beta-og alfa-celler. Funktionel beta cellemasse bestemmes ved den anatomiske beta cellemassen såvel som evnen af beta-cellerne til at reagere på en næringsstof. Et tab af funktionel beta-cellemasse er centralt for både store former for diabetes 1-3. De faldende funktionelle beta-cellemasse resultater fra en autoimmun angreb i type 1 diabetes, i type 2-diabetes denne decrement udvikler sig fra både en manglende evne til beta-celler til at udskille insulin hensigtsmæssigt og ødelæggelse af beta-celler fra en gruppe af mekanismer. Således bestræbelser på at genoprette funktionelle beta-cellemasse er altafgørende for den bedre behandling af og mulige behandlinger for diabetes.
Bestræbelser i gang for at identificere molekylære reaktionsveje, der kan udnyttes til at stimulere replikation og forbedre funktionen af beta-celler.Ideelt ville terapeutiske mål at forbedre både beta-celle vækst og funktion. Måske mere vigtigt er dog at identificere, om en strategi, der stimulerer beta cellevækst kommer på bekostning af svække beta-celle funktion (såsom med nogle onkogener) og vice versa.
Ved systematisk at undertrykke eller overudtrykker ekspression af målgener i isolerede rotte-øvævsceller, kan man identificere potentielle terapeutiske mål for forøgelse funktionel beta cellemasse 4-6. Adenovirale vektorer kan anvendes til effektivt at overudtrykke eller knockdown proteiner i isolerede rotte-øvævsceller 4,7-15. Her præsenteres en fremgangsmåde til at manipulere genekspression anvender adenovirale transduktion og vurdere islet replikation og beta celle funktion i isolerede rotte-øvævsceller (figur 1). Denne fremgangsmåde er blevet anvendt tidligere til at identificere nye mål, som modulerer beta cellereplikation eller funktion 5,6,8,9,16,17.
Protocol
Discussion
Oprettelse veje, der kan moduleres til at stimulere replikation og forbedre funktionen af beta-cellerne er relevante for begge større former for diabetes. Fordi funktionelle beta-cellemasse er afhængig af eksistensen og funktionen af insulinproducerende celler, vurdere disse faktorer samtidig har sine fordele. Denne protokol beskrives en strømlinet protokol for at identificere, hvorvidt overekspression eller undertrykkelse af et protein fører til ændringer i funktionel beta cellemasse in vitro,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud DK078732 fra NIH (til PTF).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| RPMI 1640 media | Gibco | 11879 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 6-well plate | BD-Falcon | 35-1146 | Non-TC treated |
| [methyl-3H]-thymidine | Perkin Elmer | NET027Z001MC | 1 mCi/ml |
| Micro-centrifuge tubes | Denville | C2170 | 1.7 ml |
| NaCl | Sigma | 59888 | |
| KCl | Acros | 42409 | |
| KH2PO4 | Acros | 20592 | |
| MgSO4 | Acros | 41348 | |
| CaCl2 | Acros | 34961 | |
| HEPES | Sigma | H0887 | 1 M solution |
| 35% BSA | Sigma | A7979 | |
| NaHCO3 | Acros | 42427 | |
| d-glucose | Sigma | G8769 | |
| TCA | Fisher Scientific | SA9410-1 | 10% w/v |
| NaOH | Acros | 12426 | |
| Scintillation counting tube | Sarstedt | 58.536 | 7 ml, PP |
| Scintillation counting tube cap | Sarstedt | 65.816 | |
| Econo-Safe counting cocktail | RPI | 111175 | |
| Insulin RIA | Siemens | TKIN2 | |
| BCA Assay Kit | Thermo Scientific | 23250 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Scintillation counting tube rack | Sarstedt | 93.1431.001 | |
| Liquid scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb 2910TR |
Riferimenti
- Ferrannini, E. beta-Cell function in subjects spanning the range from normal glucose tolerance to overt diabetes: a new analysis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 493-500 (2005).
- Weyer, C., Bogardus, C., Mott, D. M., Pratley, R. E. The natural history of insulin secretory dysfunction and insulin resistance in the pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. J. Clin. Invest. 104, 787-794 (1999).
- Keenan, H. A. Residual insulin production and pancreatic ss-cell turnover after 50 years of diabetes: Joslin Medalist Study. Diabetes. 59, 2846-2853 (2010).
- Bain, J. R., Schisler, J. C., Takeuchi, K., Newgard, C. B., Becker, T. C. An adenovirus vector for efficient RNA interference-mediated suppression of target genes in insulinoma cells and pancreatic islets of langerhans. Diabetes. 53, 2190-2194 (2004).
- Fueger, P. T. Trefoil factor 3 stimulates human and rodent pancreatic islet beta-cell replication with retention of function. Mol. Endocrinol. 22, 1251-1259 (2008).
- Schisler, J. C. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol. Cell Biol. 28, 3465-3476 (2008).
- Chan, C. B. Overexpression of uncoupling protein 2 inhibits glucose-stimulated insulin secretion from rat islets. Diabetes. 48, 1482-1486 (1999).
- Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53, 149-159 (2004).
- Icyuz, M. Adenovirus infection activates akt1 and induces cell proliferation in pancreatic islets1. Transplantation. 87, 821-824 (2009).
- Kaneto, H. Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress. J. Biol. Chem. 276, 31099-31104 (2001).
- Antinozzi, P. A., Berman, H. K., O’Doherty, R. M., Newgard, C. B. Metabolic engineering with recombinant adenoviruses. Annu. Rev. Nutr. 19, 511-544 (1999).
- Newgard, C. B., Becker, T. C., Berman, H. K., O’Doherty, R. M. Regulation of overexpressed hexokinases in liver and islet cells. Biochem. Soc. Trans. 25, 118-122 (1997).
- Becker, T. C., BeltrandelRio, H., Noel, R. J., Johnson, J. H., Newgard, C. B. Overexpression of hexokinase I in isolated islets of Langerhans via recombinant adenovirus. Enhancement of glucose metabolism and insulin secretion at basal but not stimulatory glucose levels. J. Biol. Chem. 269, 21234-21238 (1994).
- Csete, M. E. Adenoviral-mediated gene transfer to pancreatic islets does not alter islet function. Transplant Proc. 26, 756-757 (1994).
- Csete, M. E. Efficient gene transfer to pancreatic islets mediated by adenoviral vectors. Transplantation. 59, 263-268 (1995).
- Meng, Z. X. Activation of liver X receptors inhibits pancreatic islet beta cell proliferation through cell cycle arrest. Diabetologia. 52, 125-135 (2009).
- Ronnebaum, S. M. A pyruvate cycling pathway involving cytosolic NADP-dependent isocitrate dehydrogenase regulates glucose-stimulated insulin secretion. J. Biol. Chem. , (2006).
- Milburn, J. L. Pancreatic beta-cells in obesity. Evidence for induction of functional, morphologic, and metabolic abnormalities by increased long chain fatty acids. J. Biol. Chem. 270, 1295-1299 (1995).
- Szot, G., Koudria, P., Bluestone, J. Murine Pancreatic Islet Isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
