Het creëren van Defined Gasvormige omgevingen om de gevolgen van hypoxie Studie naar<em> C. elegans</em
Summary
Dit document beschrijft hoe u continue-stroom hypoxie kamers te gebruiken om atmosferen met bepaalde concentraties van O genereren<sub> 2</sub> Om biologische reacties te begrijpen van een verminderde O<sub> 2</sub>. Dit systeem is eenvoudig te installeren en te onderhouden, en flexibel genoeg om een breed scala van O passen<sub> 2</sub> Concentraties en modelsystemen
Abstract
Zuurstof is essentieel voor alle meercelligen om te overleven, met een bekende uitzondering 1. Verminderde O 2 beschikbaarheid (hypoxie) kan tijdens het landen van de ziekte, normale ontwikkeling of veranderingen in de omgeving 2-5. Het begrijpen van de cellulaire signaalwegen die betrokken zijn bij de respons op hypoxie kunnen bieden nieuwe inzichten in behandelingsstrategieën voor diverse menselijke ziekten, van een beroerte tot kanker. Dit doel werd echter belemmerd, althans gedeeltelijk, door technische problemen in verband met gecontroleerde hypoxie in genetisch vatbaar modelorganismen.
De nematode Caenorhabditis elegans is bij uitstek geschikt als modelorganisme voor de studie van hypoxische respons, want het is gemakkelijk te kweken en te manipuleren genetisch. Bovendien is het mogelijk om cellulaire reacties op specifieke hypoxische O 2-concentraties te bestuderen zonder verstorende effect aangezien C. elegans te verkrijgen O 2 (en andere gassen) door diffusie, in tegenstelling tot een vereenvoudigde ademhalingswegen 6. Factoren die betrokken zijn bij de reactie op hypoxie geconserveerd zijn in C. elegans. De feitelijke reactie op hypoxie afhankelijk van de specifieke concentratie O 2 die beschikbaar is. In C. elegans, blootstelling aan hypoxie matig een transcriptionele respons gemedieerd grotendeels door HIF-1 lokt, de hoog-geconserveerde hypoxie-induceerbare transcriptie factor 6-9. C. elegans embryo's nodig HIF-1 om te overleven in 5,000-20,000 ppm O 2 7,10 . Hypoxie is een algemene term voor "minder dan normale O 2". Normoxia (normaal O 2) kunnen ook moeilijk te definiëren. Wij het algemeen van mening lucht in de ruimte, dat is 210.000 ppm O 2 te zijn normoxia. Er is echter gebleken dat C. elegans heeft een gedrags-voorkeur voor O 2 concentraties van 5-12% (50,000-120,000 ppm O 2) 11. In larvae en volwassenen, HIF-1 werkt aan hypoxie-geïnduceerde diapauze te voorkomen bij 5.000 ppm O 2 12. Echter HIF-1 geen rol spelen in de reactie op lagere concentraties O 2 (anoxie operationele definitie <10 ppm O 2) 13. In anoxie, C. elegans aangaat een reversibele toestand van schijndood waarin alle microscopisch waarneembare activiteit staakt 10. Het feit dat verschillende fysiologische reacties optreden in verschillende omstandigheden benadrukt het belang van het hebben van experimentele controle over de hypoxische concentratie van O 2.
Hier presenteren we een methode voor de constructie en uitvoering van het milieubeleid kamers die betrouwbare en reproduceerbare hypoxische condities te produceren met bepaalde concentraties van O 2. De voortdurende stroom methode zorgt voor een snelle evenwichtsinstelling van de kamer en verhoogt de stabiliteit van het systeem. Daarnaast is de transparantie entoegankelijkheid van de kamers geven directe visualisatie van de dieren worden blootgesteld aan hypoxie. We zien verder een effectieve methode van oogsten C. elegans monsters snel na blootstelling aan hypoxie, die nodig is om veel snel omgekeerde veranderingen die optreden in hypoxie 10,14 nemen. Deze methode levert een fundament dat gemakkelijk kan worden aangepast voor individuele behoeften laboratorium, waaronder verschillende modelsystemen en verschillende gassen.
Protocol
Discussion
Deze methode een strategie voor het construeren een hypoxische omgeving waarin voor omgevingen nauwkeurige zuurstofconcentraties worden gehandhaafd in het laboratorium. Deze kamers een eenvoudige werkwijze voor het belichten organismen specifieke lage concentraties O 2 en controle van de moleculaire en fysiologische uitgangen. De beschreven klimaatkamer wordt samengesteld door het laboratorium plaats van commercieel gekocht en kan dus worden aangepast aan de behoeften van het experiment te passen.
<p clas…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de leden van de Miller lab voor discussie en kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een nieuwe Investigator Award van de Nathan Shock Center of Excellence in de fundamentele biologie van veroudering te DLM en de National Institutes of Health award R00 AG030550 naar DLM.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon |
YO-95821-00 (1/8″ FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8″ PTFE)’ R-3603 |
| Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16″) 06363-62 (F. coupler 1/16″) 06363-60 (M. coupler 1/8″) 06363-61 (F. coupler 1/8″) |
| Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) |
| Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) |
| Compressed gas tank | AirGas | Made to order |
| Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16″) |
| Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order |
| Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4″ nut) B-200-3 (1/8″ union tee) B-400-set (1/4″ ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8″ male conn) |
| Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
| AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) |
| Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) |
| Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 |
| Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 |
| 100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |
Riferimenti
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30 (2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Cervical Cancer. Ricerca sul cancro. 60, 4693-4696 (2000).
- Harris, A. L. Hypoxia – a key regulatory factor in tumour growth. Nat. Rev. Cancer. 2, 38-47 (2002).
- Ramirez-Bergeron, D. L. Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development. Development. 131, 4623-4634 (2004).
- Staff, F. E. Wheel-well Stowaways Risk Lethal Levels of Hypoxia and Hypothermia. Human Factors and Aviation. 44, 1-5 (1997).
- Shen, C., Powell-Coffman, J. A. Genetic Analysis of Hypoxia Signaling and Response in C. elegans. Annals of the New York Academy of Sciences. 995, 191-199 (2003).
- Shen, C., Nettleton, D., Jiang, M., Kim, S. K., Powell-Coffman, J. A. Roles of the HIF-1 Hypoxia-inducible Factor during Hypoxia Response in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280, 20580-20588 (2005).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 5510-5514 (1995).
- Epstein, A. C. R. C. elegans EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation. Cell. 107, 43-54 (2001).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended Animation in C. elegans Requires the Spindle Checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Gray, J. M. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430, 317-322 (2004).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. Elegans Are Protected from Lethal Hypoxia by an Embryonic Diapause. Current Biology. 19, 1233-1237 (2009).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hu, C. -. J., Wang, L. -. Y., Chodosh, L. A., Keith, B., Simon, M. C. Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1{alpha} (HIF-1{alpha}) and HIF-2{alpha} in Hypoxic Gene Regulation. Molecular and Cellular Biology. 23, 9361-9374 (2003).
- Treinin, M. HIF-1 is required for heat acclimation in the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Genomics. 14, 17-24 (2003).
- Miller, D. L., Roth, M. B. Hydrogen sulfide increases thermotolerance and lifespan in Caenorhabditis elegans. PNAS. 104, 20618-20622 (2007).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Salceda, S., Caro, J. Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) Protein Is Rapidly Degraded by the Ubiquitin-Proteasome System under Normoxic Conditions. Journal of Biological Chemistry. 272, 22642-22647 (1997).
- Theilacker, J. C., White, M. J. Diffusion of Gases in Air and Its Affect on Oxygen Deficiency Hazard Abatement. AIP Conference Proceedings. 823, 305-312 (2006).
- Chua, B., Kao, R. L., Rannels, D. E., Morgan, H. E. Inhibition of protein degradation by anoxia and ischemia in perfused rat hearts. Journal of Biological Chemistry. 254, 6617-6623 (1979).
- Probst, G., Riedinger, H., Martin, P., Engelcke, M., Probst, H. Fast Control of DNA Replication in Response to Hypoxia and to Inhibited Protein Synthesis in CCRF-CEM and HeLa Cells. Biological Chemistry. 380, 1371-1382 (1999).
- Semenza, G. L., Sen, C. K. . Oxygen Sensing. 381, (2004).
- Chan, K., Roth, M. B. Anoxia-Induced Suspended Animation in Budding Yeast as an Experimental Paradigm for Studying Oxygen-Regulated Gene Expression. Eukaryotic Cell. 7, 1795-1808 (2008).
- Nystul, T. G., Roth, M. B. Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans. PNAS. 101, 9133-9136 (2004).
