Skapa Definierade Gasformiga miljöer för att studera effekterna av Hypoxi på<em> C. elegans</em
Summary
Denna uppsats beskriver hur du använder kontinuerligt flöde hypoxi kamrar för att skapa atmosfärer med definierade koncentrationer av O<sub> 2</sub> Att förstå biologiska svar på minskad O<sub> 2</sub>. Detta system är enkelt att installera och underhålla, och flexibel nog att passa ett brett spektrum av O<sub> 2</sub> Koncentrationer och modellsystem
Abstract
Syre är nödvändigt för alla metazoer att överleva, med en känd undantag 1. Minskad O 2 tillgänglighet (hypoxi) kan uppstå vid tillstånd av sjukdom, en normal utveckling eller förändringar i miljöförhållanden 2-5. Förstå de cellulära signalvägar som är involverade i svar på hypoxi skulle kunna ge nya insikter om behandlingsstrategier för olika mänskliga sjukdomar, från stroke till cancer. Detta mål har hindrat, åtminstone delvis, av tekniska svårigheter i samband med kontrollerad hypoxisk exponering i genetiskt mottagliga modellorganismer.
Nematoden Caenorhabditis elegans är idealiskt lämpad som en modell organism för studium av hypoxisk respons, eftersom det är lätt att odla och genetiskt manipulera. Dessutom är det möjligt att studera cellulära svar på specifika hypoxiska O 2 koncentrationer utan störande effekter eftersom C. elegans få O 2 (och andra gaser) genom diffusion, i motsats till en förenklad andningsorganen 6. Faktorer som är kända att vara inblandade i svaret på hypoxi bevaras i C. elegans. Den faktiska svar på hypoxi beroende på den specifika koncentration av O 2 som är tillgänglig. I C. elegans, framkallar exponering för måttliga hypoxi en transkriptionell svar förmedlas till stor del av HIF-1, högt bevarade hypoxi-inducerbar transkription faktor 6-9. c. elegans embryon kräver HIF-1 för att överleva i 5,000-20,000 ppm O2 7,10 . Hypoxi är en allmän term för "mindre än normalt O 2". Normoxi (normal O 2) kan också vara svårt att definiera. Vi anser generellt rumsluft, vilket är 210.000 ppm O 2 för att vara normoxi. Emellertid har det visat sig att C. elegans har en beteendevetenskaplig föredrar O 2 halter från 5-12% (50,000-120,000 ppm O 2) 11. I Larvae och vuxna, HIF-1 verkar för att förhindra hypoxi-inducerad diapause i 5000 ppm O2 12. Emellertid spelar HIF-1 inte en roll i svaret till lägre koncentrationer av O 2 (anoxi, operationell definition <10 ppm O2) 13. I anoxi, C. elegans ingår ett reversibelt tillstånd av skendöd där alla mikroskopiskt iakttagbara verksamhet upphör 10. Det faktum att olika fysiologiska reaktioner förekommer i olika förhållanden belyser vikten av att ha experimentell kontroll över hypoxiska koncentrationen av O 2.
Här presenterar vi en metod för konstruktion och genomförande av miljökammare som producerar tillförlitliga och reproducerbara hypoxiska förhållanden med definierade koncentrationer av O 2. Den kontinuerliga flödesmetoden säkerställer snabb ekvilibrering av kammaren och ökar stabiliteten hos systemet. Dessutom är öppenhet ochtillgängligheten av kamrarna möjliggör direkt visualisering av djur som utsätts för hypoxi. Vi visar dessutom en effektiv metod för att skörda C. elegans prover snabbt efter exponering för hypoxi, vilket är nödvändigt för att observera många av de snabbt omvända förändringar som sker i hypoxi 10,14. Denna metod ger ett grundläggande fundament som lätt kan modifieras för enskilt laboratorium behov, inklusive olika modellsystem och en mängd olika gaser.
Protocol
Discussion
Denna metod uppvisar en strategi för att konstruera en hypoxisk miljö som tillåter för miljöer med exakta koncentrationer av syre som skall bibehållas i laboratoriet. Dessa kammare tillhandahålla en enkel metod för att exponera organismer till specifika låga koncentrationer av O 2 och övervaka de molekylära och fysiologiska resultat. Den omgivande kammaren beskrivits monteras genom labbet stället för kommersiellt inköpt och kan således modifieras för att passa behoven av experimentet.
<p c…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmar Miller lab för diskussion och kritisk läsning av manuskriptet. Detta arbete stöddes av en ny utredare utmärkelse från Nathan Shock Center of Excellence i Basic Biology of Aging till DLM och National Institutes of Health utmärkelse R00 AG030550 till DLM.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Tubing (FEP and PTFE) | Cole Parmer Tygon |
YO-95821-00 (1/8″ FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8″ PTFE)’ R-3603 |
| Compression fittings | Seattle Fluid Systems | 06363-58 (M. coupler 1/16″) 06363-62 (F. coupler 1/16″) 06363-60 (M. coupler 1/8″) 06363-61 (F. coupler 1/8″) |
| Flow tube | Aalborg | PMR3-010073 (3 output) PMR1-013520 (1 output) |
| Mass flow controller | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) |
| Compressed gas tank | AirGas | Made to order |
| Plastic male Luer to hose barb fittings | Cole Parmer | 45505-41 (500 series 1/16″) |
| Cast acrylic boxes | Ellard Instrumentation | Made to order |
| Pipe fittings (Brass or stainless steel) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4″ nut) B-200-3 (1/8″ union tee) B-400-set (1/4″ ferrules) B-QM2-B1-200 (QM Body QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8″ male conn) |
| Dow Corning Vacuum Grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
| AnaeroPack box | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0.4 liter) R685025 (2.5 liter) R685070 (7.0 liter) |
| Pyrex gas wash bottle | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) |
| Palmitic acid | Sigma-Aldrich | P0500 |
| Goat anti-mouse IgG-horseradish peroxidase | Southern Biotechnology Associates | 1032-05 |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent Substrate | Pierce Chemical | 34077 |
| 100 x 50 glass crystallization dishes | Kimax Kimble | 23000 |
Riferimenti
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30 (2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Cervical Cancer. Ricerca sul cancro. 60, 4693-4696 (2000).
- Harris, A. L. Hypoxia – a key regulatory factor in tumour growth. Nat. Rev. Cancer. 2, 38-47 (2002).
- Ramirez-Bergeron, D. L. Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development. Development. 131, 4623-4634 (2004).
- Staff, F. E. Wheel-well Stowaways Risk Lethal Levels of Hypoxia and Hypothermia. Human Factors and Aviation. 44, 1-5 (1997).
- Shen, C., Powell-Coffman, J. A. Genetic Analysis of Hypoxia Signaling and Response in C. elegans. Annals of the New York Academy of Sciences. 995, 191-199 (2003).
- Shen, C., Nettleton, D., Jiang, M., Kim, S. K., Powell-Coffman, J. A. Roles of the HIF-1 Hypoxia-inducible Factor during Hypoxia Response in Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 280, 20580-20588 (2005).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 5510-5514 (1995).
- Epstein, A. C. R. C. elegans EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation. Cell. 107, 43-54 (2001).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended Animation in C. elegans Requires the Spindle Checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Gray, J. M. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430, 317-322 (2004).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. Elegans Are Protected from Lethal Hypoxia by an Embryonic Diapause. Current Biology. 19, 1233-1237 (2009).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hu, C. -. J., Wang, L. -. Y., Chodosh, L. A., Keith, B., Simon, M. C. Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1{alpha} (HIF-1{alpha}) and HIF-2{alpha} in Hypoxic Gene Regulation. Molecular and Cellular Biology. 23, 9361-9374 (2003).
- Treinin, M. HIF-1 is required for heat acclimation in the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Genomics. 14, 17-24 (2003).
- Miller, D. L., Roth, M. B. Hydrogen sulfide increases thermotolerance and lifespan in Caenorhabditis elegans. PNAS. 104, 20618-20622 (2007).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Salceda, S., Caro, J. Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) Protein Is Rapidly Degraded by the Ubiquitin-Proteasome System under Normoxic Conditions. Journal of Biological Chemistry. 272, 22642-22647 (1997).
- Theilacker, J. C., White, M. J. Diffusion of Gases in Air and Its Affect on Oxygen Deficiency Hazard Abatement. AIP Conference Proceedings. 823, 305-312 (2006).
- Chua, B., Kao, R. L., Rannels, D. E., Morgan, H. E. Inhibition of protein degradation by anoxia and ischemia in perfused rat hearts. Journal of Biological Chemistry. 254, 6617-6623 (1979).
- Probst, G., Riedinger, H., Martin, P., Engelcke, M., Probst, H. Fast Control of DNA Replication in Response to Hypoxia and to Inhibited Protein Synthesis in CCRF-CEM and HeLa Cells. Biological Chemistry. 380, 1371-1382 (1999).
- Semenza, G. L., Sen, C. K. . Oxygen Sensing. 381, (2004).
- Chan, K., Roth, M. B. Anoxia-Induced Suspended Animation in Budding Yeast as an Experimental Paradigm for Studying Oxygen-Regulated Gene Expression. Eukaryotic Cell. 7, 1795-1808 (2008).
- Nystul, T. G., Roth, M. B. Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans. PNAS. 101, 9133-9136 (2004).
