Descriviamo un metodo integrato per la precisione, l'impianto stereotassico di cellule umane di glioblastoma multiforme nel cervello di topi nudi e seriali successiva In vivo Immagini per monitorare la crescita e la risposta al trattamento degli xenotrapianti risultanti.
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Articolo metodologico
Stereotassica impianto intracranico e
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il glioblastoma multiforme (GBM) è un alto grado cancro al cervello primario con una sopravvivenza mediana di soli 14,6 mesi negli esseri umani nonostante norma tri-modalità di trattamento costituito da resezione chirurgica, post-operatorio radioterapia e temozolomide chemioterapia 1. Nuovi approcci terapeutici sono chiaramente necessari per migliorare la sopravvivenza dei pazienti e la qualità della vita. Lo sviluppo di strategie terapeutiche più efficaci sarebbe aiutato da modelli animali di GBM che ricapitolare malattia umana consente ancora di imaging di serie per monitorare la crescita del tumore e la risposta al trattamento. In questo articolo, descriviamo la nostra tecnica per l'impianto stereotassico precisa di cellule bio-GBM stampabili cancro nel cervello di topi nudi con conseguente xenotrapianti tumorali che ricapitolano principali caratteristiche cliniche della GBM 2. Questo metodo produce tumori che sono riproducibili e sono situati in sedi anatomiche precise, consentendo imaging in vivo bioluminescente di monitorare in serie intraxenotrapianto crescita cranica e la risposta ai trattamenti 3-5. Questo metodo è anche ben tollerato dagli animali con bassa morbilità e la mortalità perioperatoria.
Protocollo
A. pre-operatoria del tumore Preparazione cellulare
- Trasdurre cellule di glioblastoma multiforme U251 con un vettore di espressione lentivirali (pGreenFire, Sistema Biosciences) per esprimere stabilmente il gene della luciferasi lucciola.
- Queste cellule sono state coltivate in 10 ml di completa modifica Dulbecco di mezzo di Eagle (DMEM), che consiste in DMEM supplementato con 10% siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina, e 1% di amminoacidi non essenziali in una beuta T75 coltura tissutale incubando 5% di C0 2 e 37 ° C.
- Effettuare coltura cellulare standard, iniziando con lavaggio delle cellule con tampone fosfato salino (PBS) seguita da trypsinizing.
- Estinguere la tripsina con DMEM completo, trasferire la soluzione in un matraccio da 50 ml e determinare la concentrazione cellulare usando il contatore Coulter.
- Centrifugare le cellule raccolte in DMEM completo per 3 min a circa 3000 giri al minuto.
- Dopo la centrifugazione, aspirare dif media lasciando solo un pellet di cellule sul fondo del pallone da 50 ml.
- Lavorando rapidamente per evitare che le cellule si secchi, risospendere le cellule in un volume di DMEM completo fresco per ottenere la concentrazione desiderata di 50.000 cellule / microlitro e trasferimento in una fiala da 2 ml sterile posti su ghiaccio.
- Celle sul ghiaccio vanno brevemente in agitazione su un livello basso ogni ~ 20 minuti per evitare l'adesione cellulare. Le celle possono essere tranquillamente utilizzato per implantologia intracranici fino a due ore dopo il posizionamento sul ghiaccio.
B. Impianto Xenograft ortotopico
- Pesare nude atimico nCr mouse (nu / nu) per stabilire una, linea di base pre-impianto peso. Noi di solito selezionare topi 6-10 settimane di età con pesi tra 17 e 24 grammi.
- 1 ora prima dell'impianto, pre-medicare il mouse con 5 mg / kg della non-steroidei farmaci anti-infiammatori meloxicam per via sottocutanea come trattamento post-operatorio dolore e l'infiammazione.
- Anesthetize l'animale con una iniezione intraperitoneale di ketamina / xilazina miscela ad una dose di 140 mg / kg e 10 mg / kg rispettivamente.
- Verificare che il mouse sia sufficientemente anestetizzato valutando risposta spontanea dell'animale ad un pizzico punta. Se l'animale risponde al pizzico punta, ritardare la procedura fino a quando l'anestesia può avere effetto o prendere in considerazione l'iniezione di anestesia supplementare (<25% del valore originale).
- Preparare il mouse anestetizzato per il posizionamento in digitale Stoelting Solo per piattaforma mouse stereotassica (Stoelting Inc.) agganciando incisivi del mouse nella barra morso della restrainer muso e stringendo il morsetto naso sul muso, garantendo nel contempo che la testa del mouse si trova su un piano di livello.
- Trasferire il mouse trattenuto alla piattaforma stereotassica Stoelting, regolando il posizionamento dell'animale in modo che le punte delle barre orecchio sono all'estremità caudale del canale uditivo. Una volta che l'animale cranio-caudale per-posizionamento è adjusted, fissare la barra morso al telaio stereotassico. Il mouse deve essere appoggiato su una piastra riscaldante ditta plastica (Harvard Apparatus) fissato con nastro alla piattaforma Stoelting per fornire un feedback controllato regolazione della temperatura durante l'intervento chirurgico.
- Regolare l'altezza delle barre orecchio come necessario e poi avanzare le barre orecchio nella porzione caudale del canale uditivo, garantendo loro in modo tale che la testa del mouse è in un piano di livello e immobilizzato su tocco di un dito. Monitorare attentamente per eventuali segni di distress respiratorio dopo il posizionamento delle barre orecchio. Allentare e riposizionare se l'animale è in difficoltà.
- Inserire la punta lubrificata di una sonda di temperatura rettale collegato al TCAT-2DF termoregolatore (Apparato Harvard) per monitorare la temperatura dell'animale e per fornire controllo in retroazione alla piastra riscaldante posizionata sotto il mouse per mantenere la temperatura corporea dell'animale a 36 ° C durante la procedura.
- Applicare una pomata oftalmica per gli occhi di Prevent essiccazione.
- Applicare la soluzione betadine alla parte superiore della testa del mouse per disinfettare il sito di incisione, avendo cura di evitare gli occhi.
- Eseguire un pizzico punta a confermare il mouse è inconscio, fornendo una piccola quantità di ketamina supplementari / xilazina (<25% della dose iniziale), se necessario.
- Pulire la punta mm 0,45 bava (Stoelting) attaccato al trapano (Foredom Microdrill) con un tampone imbevuto di alcool e poi sterilizzare la punta da trapano in una bolla di vetro sterilizzatore (germinator 500, CellPoint scientifico) per 15 secondi, immergendo solo la punta nel Lo sterilizzatore perline.
- Usando un bisturi sterile, fare una incisione 0,75 centimetri longitudinalmente a metà del cuoio capelluto si estende dal livello degli occhi caudalmente. Confermare la visualizzazione del bregma.
- Fissare il supporto punta alla piattaforma Stoelting e inserire un trapano (Foredom Microdrill) con un trapano punta 0,45 mm Fresa (Stoelting) nel supporto trapano, fissandolo in posizione.
- Posizionare la punta esattamente sul tegli bregma e poi zero il x, y, z coordinate del display stereotassico digitale. Spostare la punta del trapano ad un millimetro posizione 2 e 1,5 mm posteriore al bregma laterale nell'emisfero cerebrale destro e trapano nel cranio dell'animale con il trapano Foredom, perforando solo l'osso. Un tampone di cotone sterile può essere utilizzato per ritrarre delicatamente i bordi dell'incisione per facilitare la visualizzazione del cranio.
- Rimuovere il trapano e la punta titolare dalla piattaforma stereotassica.
- Fissare la Nanomite iniettore pompa a siringa (Apparato Harvard) alla piattaforma stereotassica.
- Rimuovere le cellule dal ghiaccio e sia vortice delicatamente il flaconcino contenente le cellule tumorali con brevi impulsi o picchietti leggermente la fiala per risospendere le cellule. Disegna il 7 microlitri della sospensione cellulare attraverso un calibro 30 1 "lungo ago smusso piatto collegato a una siringa da 10 microlitri (Hamilton siringa). Evitare grosse bolle d'aria nella siringa. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nel iniziale 6 ml di liquido which sarà il volume totale iniettato nel topo. Piccole bolle d'aria nel restante 1 ml sono di alcuna preoccupazione. Evitare la ripetizione di draw-up della sospensione, se possibile, per ridurre al minimo i danni alle cellule.
- Posizionare la siringa caricata nell'iniettore siringa. Utilizzando un tampone di alcool, rimuovere il fluido sospensione cellulare che appare sulla punta dell'ago per evitare la contaminazione del sito di incisione con cellule tumorali che possono causare tumore in crescita nello spazio extracranica.
- Impostare la pompa iniettore per fornire 6,0 microlitri a una velocità di 0,5 microlitri / min. Il 1 ml di sospensione cellulare rimanente nella siringa dopo l'impianto assicura che le bolle d'aria che spesso raccolgono nella siringa non sono iniettato nell'animale. L'iniezione di bolle d'aria potrebbe risultare in un embolia gassosa mortale.
- Far avanzare l'ago della siringa nel foro cranico mantenere la perpendicolare ago (90 gradi) al cranio. Una volta che l'ago ha attraversato il cranio, a zero il coordinAtes sul display stereotassico digitale e poi lentamente avanzare la punta dell'ago per un periodo di 4 min fino a raggiungere una profondità di 2,5 mm. L'ago passa attraverso la corteccia e porzioni dell'ippocampo posteriore. L'x, y, z coordinate per impianto stereotassico stati scelti per generare un tumore posizionato lateralmente all'interno dell'emisfero cerebrale evitando lesioni alle strutture cerebrali critiche come il talamo e la vicinanza ai ventricoli riducendo così la probabilità di semina del liquido cerebrospinale con cellule tumorali che possono dar luogo a indesiderabili tumori spinali. Una posizione posteriore rispetto al bregma è stato selezionato per ridurre la probabilità di un grande, tumore localmente avanzato ulcerante nell'orbita. Pausa con l'ago in profondità per 2 minuti e quindi avviare l'impianto di cellule.
- Durante l'impianto, asciugare il cranio ripetutamente con una lancia microchirurgica spugna per rimuovere qualsiasi tumore fluido contenente eventualmente ricadere su foro cranico duranteimpianto. Evitare di interrompere l'ago con la spugna microchirurgico. La rimozione di questo fluido dovrebbe ridurre il rischio di tumore cresce nello spazio extracranica.
- Dopo l'iniezione è terminata, lasciare l'ago nel cervello per circa 2 min e quindi estrarre lentamente l'ago in un periodo di 3-4 min.
- Allentare le barre per le orecchie e muso dispositivo di immobilizzazione e rimuovere il mouse dall'apparecchio stereotassica.
- Chiudere il foro cranico nel cranio con la cera ossea sterile depositato da sfregamento cera avanti e indietro attraverso il buco bava dalla fine di legno di una sterile con punta di cotone applicatore. Continuare ad applicare cera ossea finché il foro è completamente sigillato e la cera ossea sigillare il foro cranico è a filo con il cranio adiacente.
- Re-approssimativi i bordi della incisione con tamponi di cotone sterili e applicare la colla veterinaria tessuto per sigillare la ferita, avendo cura di evitare l'esposizione colla occhi dell'animale.
- Infine, posizionare il mouse su un rilievo di riscaldamento impostato a 37 °C finché l'animale recupera coscienza. Trasferire l'animale alla sua gabbia originale una volta che il mouse è vigile e reattivo.
C. Bioluminescent Imaging (BLI) per monitorare la crescita del tumore e la risposta alla terapia
Brevi istruzioni seguire per l'imaging bioluminescente.
- Anestetizzare topi precedentemente impiantati con tumore in una camera con 2% di isoflurano e ossigeno.
- Mentre i topi vengono anestetizzati, li iniettare per via sottocutanea o intraperitoneale con 60 pl di D-luciferina sale di potassio diluito in PBS ad una concentrazione di 50 mg / ml.
- Accendere il flusso di anestesia per i coni d'ogiva nello scanner di imaging bioluminescente e trasferire rapidamente i topi allo scanner mettere il muso nei coni naso.
- Posizionare divisori neri tra i topi di limitare l'emorragia del segnale bioluminescente da un tumore con elevata intensità di segnale di un tumore adiacente con segnale molto più basso.
- Utilizzoil software di immagine vivente, fare frequenti esposizioni di serie per una durata totale di fino a 30 minuti dopo l'iniezione di D-luciferina. Siamo favorevoli impostare il tempo di esposizione su "Auto" per limitare il rischio di una immagine sotto o sovraesposizione. Nessuna singola esposizione deve essere> 5 min.
- Eseguire l'imaging bioluminescente ripetere ad intervalli appropriati. Serial immagini settimanale è una scelta ragionevole per molti esperimenti longitudinali testare la risposta al trattamento.
- Dopo l'acquisizione delle immagini, utilizzare il programma software Image Living analizzare tumori disegnando una regione di interesse (ROI) intorno a ogni tumore in ogni immagine acquisita durante la sessione di imaging bioluminescente. Applicare una seconda, più piccola regione di interesse per il fianco inferiore di ciascun topo in ogni immagine come sfondo regione di interesse per correggere il segnale bioluminescente del tumore in base al grado di intensità del segnale bioluminescente sfondo. Noi preferiamo utilizzare l'impostazione "Radiance", piuttosto che "Conti" come l'uscitavalori per il segnale bioluminescente.
- Esporta i risultati del ROI in Excel e di determinare il massimo valore di background-adjusted segnale bioluminescente per ogni mouse.
- Ripetere l'imaging bioluminescente come indicato per il monitoraggio seriale di crescita tumorale. Nei nostri esperimenti, abbiamo eseguire settimanale BLI. Noi preferiamo la determinazione del segnale massimo BLI per una sessione di imaging ottenuto prendendo esposizioni frequenti più di 5 - 30 min dopo l'iniezione di D-luciferina.
D. Rappresentante Risultati
Questa tecnica di impianto stereotassico è associato un successo tumore-take tasso di 90-100% e con bassa mortalità perioperatoria che è di solito inferiore al 5%. Il rischio di effetti collaterali indesiderati è bassa anche con questa tecnica, compresi complicanze come semina del midollo spinale da cellule tumorali impiantate nei ventricoli, o extracranica crescita tumorale sia da semina di incisione con cellule tumorali o chiusura inadeguata del foro cranico unllowing tumore intracranico per espandere attraverso l'apertura nel cranio.
Analisi ex vivo di xenotrapianti di tumori attesi dimostrato aree di ipossia, aumento di espressione di VEGF, e necrosi. Microscopia a fluorescenza per la proteina fluorescente verde (GFP) stabilmente espressa dalla nostra linea cellulare GBM rivelato la natura infiltrativa di queste xenotrapianti.
La Figura 1 mostra i risultati di un tipico impianto stereotassico successo di cellule GBM nel cervello di un topo. Si tratta di una pesata in T2 scansione MRI del cervello di un topo cervello eseguita con un magnete 9.4 Tesla 21 giorni dopo l'impianto con la tecnica qui descritta. Figura 1 mostra un singolo fuoco di tumore nell'emisfero destro (sagomato in rosa) di misura 19 mm 3 che localizza alle coordinate precise del sito di impianto.
La Figura 2 mostra i risultati di imaging bioluminescente usando il tecn iques descritto qui per un gruppo di 10 topi con tumori stereotassica impiantati che sono stati stratificati in modo uniforme sulla base di massima intensità del segnale bioluminescente a ricevere irradiazione cranica (4 Gy x 4 frazioni giornaliere) o nessun trattamento. In questo esperimento, l'imaging bioluminescente mostra che la radioterapia inibisce la proliferazione dei tumori impiantati, causando alcun aumento del segnale rilevato bioluminescente, mentre il segnale aumenta sostanzialmente in mock-irradiati tumori di controllo, dovuti alla proliferazione incontrollata delle cellule tumorali.
Figura 1 (Video). Sezioni coronali risonanza magnetica di un cervello di topo contenente un U251 tumore glioblastoma multiforme con sagoma del volume del tumore (in rosa). La scansione è stata effettuata utilizzando un protocollo di spin echo T2 pesata su uno scanner 9.4 Tesla. Clicca qui per visualizzare filmati .
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Figura 2. 10 topi con tumori glioblastoma multiforme stereotassica impiantati sono stati trattati con radioterapia esterna a 16 Gy in 4 frazioni o nessun trattamento. I topi sono stati ripresi con imaging bioluminescente prima del trattamento e settimanale dopo l'inizio del trattamento. Il grafico presenta bioluminescenza relativa calcolata come mediana fold change in cui è definito fold change come il rapporto tra valore massimo corrente BLI al valore pre-trattamento massimo BLI.
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Discussione
Il metodo di impianto stereotassico di cellule tumorali nei topi descritti nel presente documento genera riproducibile tumori che ragionevolmente ricapitolano il modello infiltrativa e rapida crescita del glioblastoma multiforme clinica 2, 6-8. Questa tecnica è particolarmente adatto per esperimenti stratificando topi uniformemente a diversi gruppi di trattamento dove i tumori riproducibili di dimensioni comparabili e proprietà biologiche e in specifiche sedi anatomiche sono desiderabili. L'impianto stere...
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Siamo grati al Dr. Andrew Hollander, Sara Davis, Lee Shuman, Tim Jenkins, e il Dr. Xu Xiangsheng per la loro assistenza di un esperto. Riconosciamo il sostegno del Dr. Ann Kennedy. BCB è stata sostenuta per la formazione di Grant Radiation Biology C5T32CA009677. JFD è stato sostenuto il Premio alla Carriera Burroughs Wellcome per gli scienziati medici (1.006.792). JLB è stato sostenuto in merito alla concessione melari (5 R25 CA140116-03). Si desidera ringraziare il Dott. Steve Hahn cui incoraggiamento e il sostegno ha contribuito a rendere la nostra ricerca possibile. Vorremmo anche ringraziare l'Università della Pennsylvania Nano-Bio Interface Center (NBIC) e il Dr. Dennis Discher per incoraggiamento e utili commenti. Riconosciamo Small Animal Imaging Facility (SAIF) presso l'Università della Pennsylvania per l'utilizzo delle loro strutture di base MRI e ottico / bioluminescenza. Queste tecniche sono state sviluppate nell'ambito di progetti che sono stati finanziati dal National Institutes of Health (RC1 CA145075 e K08 NS076548-01).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Descrizione | Fornitore | Numero di catalogo | Commenti |
| Digitale Solo per mouse strumento stereotassico | Stoelting | 51730D | Piattaforma stereotassica per l'impianto del mouse |
| Ketamina / xilazina | Anestesia iniettabile | ||
| Puralube Pomata Vet (oftalmica) | Amazon.com | Per prevenire l'essiccazione degli occhi del topo | |
| forare supporto per la piattaforma stereotassica | Stoelting | 51681 | |
| Micromotore Trapano elettrico | Stoelting | 51449 | Per la foratura attraverso il cranio |
| 0,45 millimetri carburo di punta | Stoelting | 514551 | |
| Tamponi di cotone sterili | Fisher Scientific | 23-400-100 | |
| Perle di vetro a secco sterilizzatore (germinator 500) | Braintree scientifico | GER-5287 | Per sterilizzare gli strumenti chirurgici di metallo |
| Mouse sonda rettale | Braintree scientifico | RET-3-ISO | Compatibile con il regolatore di temperatura |
| Centralina di temperatura (TCAT-2DF) | Harvard Apparatus | 727561 | Regolatore di temperatura per mantenere la temperatura dell'animale durante l'intervento chirurgico |
| Piastra riscaldante Piccolo | Harvard Apparatus | 727617 | Per l'uso con il regolatore di temperatura di riscaldamento del mouse durante l'intervento chirurgico. La piastra di riscaldamento si inserisce sotto il mouse sulla piattaforma stereotassica. |
| Bisturi monouso | BD Bard-Parker | 2015-11 | # 10 bisturi |
| 10 microlitri siringa | Hamilton | 7635-01 | Per l'iniezione delle cellule tumorali |
| 30 aghi calibro, 1 "di lunghezza, con punta piana | Hamilton | Vario | Deve essere compatibile con la siringa 10 pl |
| Nanomite programmabile pompa siringa | Harvard Apparatus | 704507 | Digital siringa motorizzata iniettore per il dispositivo stereotassico |
| Cellulosa spugne sterili lancia chirurgiche | Ultracell | 40410 | Per asciugare il campo operatorio |
| Bone cera | Ethicon | W31 | Per sigillare il foro cranico |
| Tissumend II tessuto adesivo sintetico assorbibile | Veterinary Laboratories Prodotti | 3002931 | Per sigillare l'incisione |
| Pompa acqua calda con il rilievo di riscaldamento | Gaymar | TP-650 | Topi scalda in periodo post-operatorio |
| IVIS Lumina II | Caliper Life Science | Bioluminescent imager | |
| D-Luciferin sale di potassio | Oro Biotecnologie | FORTUNA-1 | Luciferina per l'imaging bioluminescente |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
