Détection des microARN dans la microglie par PCR en temps réel dans le SNC normal et pendant neuroinflammation
Summary
Les microglies sont les macrophages résidents qui fournissent la première ligne de défense et de la surveillance immunitaire du système nerveux central. Les microARN sont des molécules régulatrices qui jouent un rôle important dans de nombreux processus physiologiques, y compris l'activation et la différenciation des macrophages. Dans cet article, nous décrivons la méthode de mesure des microARN dans la microglie.
Abstract
Microglie sont des cellules de la lignée myéloïde qui résident dans le système nerveux central (SNC) 1. Ces cellules jouent un rôle important dans les pathologies de nombreuses maladies associées à la neuroinflammation tels que la sclérose en plaques (MS) 2. La microglie dans quelques SNC normal exprimer macrophages marqueur CD11b et présentent un phénotype de repos en exprimant de faibles niveaux de marqueurs d'activation tels que CD45. Lors d'événements pathologiques dans le système nerveux central, la microglie sont activés tel que déterminé par la régulation positive de CD45 et d'autres marqueurs 3. Les facteurs qui influent sur le phénotype des microglies et les fonctions dans le SNC ne sont pas bien étudiés. Les microARN (miARN) sont une famille de plus en plus de molécules conservées (~ 22 nucléotides de long) qui sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques normaux tels que la croissance et la différenciation cellulaire 4 et pathologies telles que l'inflammation 5. MiARN régulent à la baisse l'expression de certains gènes cibles en se liant des séquences complémentaires de laARNm ir et de jouer un rôle important dans l'activation des cellules immunitaires innées dont les macrophages et la microglie 6 7. Afin d'étudier les voies médiées par miRNA qui définissent le phénotype des microglies, la fonction biologique, et de distinguer les microglies d'autres types de macrophages, il est important d'évaluer quantitativement l'expression de microARN spécifiques dans des sous-ensembles distincts de SNC-résident microglie. Les méthodes courantes pour mesurer l'expression des miARN dans le SNC comprennent la PCR quantitative à partir de tissu neuronal et de toute hybridation di situ. Cependant, la PCR quantitative à partir de broyat de tissu ensemble ne permet pas l'évaluation de l'expression de miARN dans la microglie, qui ne représentent que 5-15% des cellules de tissu neuronal. Hybridation in situ permet l'évaluation de l'expression de microARN dans des types cellulaires spécifiques dans les coupes de tissus, mais cette méthode n'est pas entièrement quantitative. Dans ce rapport, nous décrivons une amélioration quantitative et sensitive méthode pour la détection de miARN par PCR en temps réel dans la microglie isolés de SNC normal ou pendant l'utilisation neuroinflammation encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE), un modèle de souris pour MS. La méthode décrite sera utile pour mesurer le niveau d'expression des microARN dans la microglie dans le SNC normal ou en neuroinflammation associée à diverses pathologies, y compris MS, accident vasculaire cérébral, un traumatisme, la maladie d'Alzheimer et les tumeurs cérébrales.
Protocol
Discussion
Récemment un intérêt significatif a été donné à la microglie et l'implication de ces cellules dans de nombreuses pathologies associées à la neuroinflammation et la neurodégénérescence. En outre, le rôle des microARN dans la différenciation des cellules immunitaires et le cancer a considérablement augmenté au cours des dernières années, plusieurs 5,10. Nous avons déjà signalé le rôle de miR-124 dans le maintien du phénotype non activé ou au repos de la microglie dans le SNC normales…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail a été soutenu par le NIH R01 NS071039-01A1 subvention de recherche.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma.
50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b–PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
Riferimenti
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