Mikroglia är bosatta makrofager som ger den första försvarslinjen och immun övervakning av det centrala nervsystemet. MikroRNA är regulatoriska molekyler som spelar en viktig roll i många fysiologiska processer, inklusive aktivering och differentiering av makrofager. I den här artikeln beskriver vi den metod för mätning av mikroRNA i mikroglia.
Mikroglia är celler av myeloid härkomst som finns under det centrala nervsystemet (CNS) 1. Dessa celler spelar en viktig roll i patologier av många sjukdomar är associerade med neuroinflammation såsom multipel skleros (MS) 2. Mikroglia i en normal CNS uttrycka makrofag markör CD11b och uppvisar en vilande fenotyp genom att uttrycka låga nivåer av aktivering markörer som CD45. Under patologiska händelser i CNS, mikroglia bli aktiverade bestämd genom uppreglering av CD45 och andra markörer 3. De faktorer som påverkar mikroglia fenotyp och funktioner i CNS är inte väl studerat. MikroRNA (miRNA) är en växande familj av konserverade molekyler (~ 22 nukleotider långa) som är involverade i många normala fysiologiska processer såsom celltillväxt och differentiering 4 och sjukdomar såsom inflammation 5. MiRNA nedreglera uttrycket av vissa målgener genom att binda komplementära sekvenser avir mRNA och spela en viktig roll i aktiveringen av medfödda immunceller, inklusive makrofager 6 och mikroglia 7. För att undersöka miRNA-medierade reaktionsvägar som definierar microglial fenotypen, biologisk funktion, och för att skilja mikroglia från andra typer av makrofager, är det viktigt att kvantitativt bedöma expression av särskilda mikroRNA i distinkta undergrupper av CNS-inhemska mikroglia. Vanliga metoder för att mäta uttrycket av miRNA i CNS innefattar kvantitativ PCR från hela neuronal vävnad och hybridisering in situ. Emellertid tillåter inte kvantitativ PCR från hela vävnadshomogenat inte bedömningen av uttrycket av miRNA i mikroglia, som representerar endast 5-15% av de celler av neuronal vävnad. Hybridisering in situ möjligt att bedöma om uttrycket av mikroRNA i specifika celltyper i de vävnadssnitt, men denna metod är inte helt kvantitativ. I denna rapport beskriver vi en kvantitativ och senstiv metod för detektion av miRNA genom realtids-PCR i mikroglia isolerades från normala CNS eller vid neuroinflammation användning experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE), en mus-modell för MS. Den beskrivna metoden är användbar för att mäta nivån av uttryckning av mikroRNA i mikroglia i normala CNS eller vid neuroinflammation associerad med olika sjukdomstillstånd inklusive MS, stroke, traumatisk skada, Alzheimers sjukdom och hjärntumörer.
Nyligen stort intresse gavs till mikroglia och engagemang av dessa celler i många patologier i samband med neuroinflammation och neurodegeneration. Dessutom har betydelsen av mikroRNA i differentieringen av immun-och cancerceller ökat dramatiskt under de senaste åren 5,10. Vi har tidigare rapporterat rollen av MIR-124 för att upprätthålla icke-aktiverade eller vilande fenotyp av mikroglia i normala CNS 7, men rollen av de andra typerna av mikroRNA i mikroglia fenotyp och aktiveringstillstånd…
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöddes av NIH R01 NS071039-01A1 forskningsanslag.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma.
50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
CFA | DIFCO | 263810 | |
Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
Anti-CD11b–PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |