דלדול המשאבים ואת הכינון מחדש של מקרופאגים בעכברים
Summary
מקרופאגים לשחק תפקיד מרכזי הומאוסטזיס והפתולוגיה ברקמות רבות. הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטות ומכלה מקרופאגים<em> In vivo</em>, הנובעת מקרופאגים מקוטב aspirates מח עצם, adoptively העברת מקרופאגים לעכברים. טכניקות אלו מאפשרים קביעת התפקיד מקרופאגים מקוטב לשחק בריאות ומחלות.
Abstract
מקרופאגים הם שחקנים קריטיים בתגובה החיסון המולדת לאתגר פגיעה זיהומית או, שיזם את התגובה החיסונית המולדת ולכוון את התגובה החיסונית הנרכשת. מקרופאג תפקוד יכול להוביל לחוסר יכולת לעלות תגובה חיסונית מתאימה, וככזה, היה מעורב בתהליכים מחלות רבות, כולל מחלות מעי דלקתיות. מקרופאגים להציג פנוטיפים מקוטב כי המחולקים באופן כללי לשני סוגים. מקרופאגים מופעל קלאסי, מופעל על ידי גירוי עם IFNγ או LPS, לשחק תפקיד חיוני בתגובה לאתגר חיידקי בעוד מקרופאגים מופעל לחילופין, מופעלים על ידי IL-4 או IL-13, להשתתף פסולת הדחה שיפוץ רקמות היו מעורבים בהחלטה השלב של דלקת. במהלך התגובה הדלקתית in vivo, מקרופאגים נמצאים בתוך תערובת מורכבת של חדירת תאים חיסוניים ועשוי להשתתף ידי העצמת או resolvinגרם לדלקת. כדי להגדיר את התפקיד של מקרופאגים באתרו במודל חיה שלמה, יש צורך לבחון את ההשפעה של ומכלה מקרופאגים מהסביבה מורכב. לשאול שאלות על תפקידו של הפנוטיפ מקרופאג באתרו, מקרופאגים מקוטב מוגדרים phenotypically ניתן לגזור vivo לשעבר, החל aspirates מח עצם והוסיף בחזרה עכברים, עם או בלי דלדול מראש של מקרופאגים. בפרוטוקול שהוצג clodronate המכיל ליפוזומים, לעומת שולטת PBS מוזרק, שימשו כדי לרוקן מקרופאגים הגס במהלך נתרן גופרתי dextran (DSS) הנגרמת קוליטיס בעכברים. בנוסף, מקרופאגים מקוטב נגזרו vivo לשעבר והועבר עכברים על ידי הזרקה תוך ורידית. הערת אזהרה על גישה זו היא כי clodronate המכיל ליפוזומים לרוקן את כל phagocytes מקצועיים, כולל שני תאים דנדריטים ומקרופגים כך כדי להבטיח את האפקט שנצפה על ידי דלדול הוא מקרופאג ספציפי, הכינון מחדש Oפנוטיפ F על ידי העברת המאמצת של מקרופאגים הכרחי. דלדול מקרופאג מערכתית בעכברים יכול גם להיות מושגת על ידי עכברים backcrossing על רקע CD11b-DTR, שהיא גישה משלימה מצוינת. היתרון של clodronate המכיל דלדול liposome בתיווך הוא שהיא אינה דורשת את הזמן ואת חשבון מעורב עכברים backcrossing והוא ניתן להשתמש בעכברים ללא קשר לרקע של העכברים (C57BL / 6, BALB / c, או רקע מעורב ).
Protocol
Discussion
מקרופאגים הם תאים phagocytic כי לשחק תפקיד חשוב במערכת החיסונית. הם אחראים ליזום את התגובה החיסונית המולדת ולכוון את התגובה החיסונית הנרכשת. בדרך כלל, מקרופאגים מופעל קלאסי מופעלים על ידי IFNγ או LPS ואחראים על סילוק פתוגנים גובר תגובה דלקתית 1. לעומת זאת, מקרופאגים מופ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי "מענק סיוע למחקר" מ קרוהן קוליטיס קרן של קנדה LMS, אשר נתמכת על ידי האגודה הקנדית לגסטרואנטרולוגיה / הקנדי איגוד הבריאות של מחקר / קרוהן ו קוליטיס קרן פרס החוקר חדש בקנדה.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Clodronate-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | |
| PBS-containing liposomes | Clodronateliposomes.org | |
| Sterile PBS pH7.4 | Invitrogen | 14190 |
| IMDM | Invitrogen | 12440 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 12483 |
| acetic acid | BDH Aristar | BDH3092-500MLP |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 96-275 |
| Recombinant murine MCSF | Stemcell Technologies | 02951 |
| Recombinant murine GM-CSF | Stemcell Technologies | 02935 |
| Recombinant murine IL-3 | Stemcell Technologies | 02903 |
| Recombinant murine IFNγ | Stemcell Technologies | 02746 |
| Recombinant murine IL-4 | Stemcell Technologies | 02714 |
| Cell Dissociation Buffer | Invitrogen | 13150-016 |
| Rat anti-F4/80 Antibody | AbD Serotec | MCA497GA |
| Mouse anti-ArgI Antibody | BD Transduction Laboratories | 610708 |
Table 1. Specific reagents used in this protocol.
Riferimenti
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Rescigno, M., Lopatin, U., Chieppa, M. Interactions among dendritic cells, macrophages, and epithelial cells in the gut: implications for immune tolerance. Curr. Opin. Immunol. 20, 669-675 (2008).
- Heinsbroek, S. E., Gordon, S. The role of macrophages in inflammatory bowel diseases. Expert Rev. Mol. Med. 11, e14 (2009).
- Collins, S. M., Piche, T., Rampal, P. The putative role of inflammation in the irritable bowel syndrome. Gut. 49, 743-745 (2001).
- Maeda, S. Colon cancer-derived factors activate NF-kappaB in myeloid cells via TLR2 to link inflammation and tumorigenesis. Mol. Med. Report. 4, 1083-1088 (2011).
- van Rooijen, N., van Kesteren-Hendrikx, E. Clodronate liposomes: perspectives in research and therapeutics. J. Liposome Res. 12, 81-94 (2002).
- Hunter, M. M. In vitro-derived alternatively activated macrophages reduce colonic inflammation in mice. Gastroenterology. 138, 1395-1405 (2010).
- Weisser, S. B. SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis. J. Leukoc. Biol. 90, 483-492 (2011).
- Qualls, J. E., Kaplan, A. M., van Rooijen, N., Cohen, D. A. Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes. J. Leukoc. Biol. 80, 802-815 (2006).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
- Smith, P. Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism. J. Immunol. 178, 4557-4566 (2007).
- van Rooijen, N., Hendrikx, E. Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol. Biol. 605, 189-203 (2010).
- Kataoka, K. The roles of vitreal macrophages and circulating leukocytes in retinal neovascularization. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 1431-1438 (2011).
- Weisser, S. B. Alternative activation of macrophages by IL-4 requires SHIP degradation. Eur. J. Immunol. 41, 1742-1753 (2011).
- Cailhier, J. F. Conditional macrophage ablation demonstrates that resident macrophages initiate acute peritoneal inflammation. J. Immunol. 174, 2336-2342 (2005).
