Bemonstering Human Inheemse Speeksel peptidoom Met behulp van een Lollipop-Like Ultrafiltratie Probe: vereenvoudigen en te verbeteren Peptide Detection voor Klinische massaspectrometrie
Summary
Rekening houdend met speeksel bemonstering voor toekomstige klinische toepassing, is een lolly-achtige ultrafiltratie (LLUF) probe gemaakt om te passen in de menselijke mondholte. Directe analyse van onverteerd speeksel door nanoLC-LTQ massaspectrometrie werd aangetoond dat LLUF sondes om grote eiwitten en een hoge overvloed eiwitten te verwijderen, en maak een lage overvloedige peptiden meer aantoonbaar.
Abstract
Hoewel het menselijk speeksel proteoom en peptidoom zijn geopenbaard 1-2 werden ze majorly geïdentificeerd uit eiwit hydrolysaten van speeksel eiwitten. Identificatie van de inheemse peptidoom van het menselijk speeksel zonder voorafgaande vertering met exogene enzymen wordt het absoluut noodzakelijk, omdat natieve peptiden in menselijk speeksel verstrekt potentiële waarden voor de diagnose van de ziekte, het voorspellen van progressie van de ziekte, en het toezicht op de therapeutische werkzaamheid. Passende steekproef is een cruciale stap voor de verbetering van de identificatie van menselijke inheemse speeksel peptidoom. Traditionele methoden van bemonstering van menselijk speeksel met centrifugeren om vuil te verwijderen 3-4 mei te veel tijd in beslag van toepassing te zijn voor klinisch gebruik. Bovendien kan vuil verwijderd door centrifugatie niet kunnen meeste geïnfecteerde pathogenen reinigen en de hoge overvloed eiwitten die vaak belemmeren de identificatie van geringe hoeveelheden peptidoom verwijderen.
Conventionele proteomische benaderingen die priMarily gebruik tweedimensionale gel-elektroforese (2-DE) gels in conjugatie met in-gel digestie staat zijn om vele speeksel eiwitten 5-6. Deze aanpak is algemeen niet gevoelig genoeg om geringe hoeveelheden peptiden / eiwitten te detecteren. Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) op basis van proteomics is een alternatief dat eiwitten zich kunnen identificeren zonder voorafgaande 2-DE-scheiding. Hoewel deze benadering levert een hogere gevoeligheid moet algemeen vooraf mon-fractionering 7 en pre-digestie met trypsine, waardoor het moeilijk voor klinisch gebruik.
Om de hinder in de massa spectrometrie als gevolg van monstervoorbereiding te omzeilen, hebben we een techniek genaamd capillaire ultrafiltratie (CUF) sondes 8-11. De gegevens van ons laboratorium aangetoond dat de CUF probes in staat zijn om het vastleggen van eiwitten in vivo van verschillende micro-omgevingen bij dieren in een dynamische en minimaal invasieve manier 8 –11. Geen centrifugeren is nodig omdat een negatieve druk wordt gecreëerd door gewoon spuit te trekken tijdens de monstername. De CUF sondes in combinatie met LC-MS hebben met succes geïdentificeerd tryptische-eiwitten verteerd 8-11. In deze studie hebben we een upgrade van de ultrafiltratie sampling techniek door het creëren van een lolly-achtige ultrafiltratie (LLUF) probe die gemakkelijk kunnen passen in de menselijke mondholte. De directe analyse van LC-MS zonder trypsinedigestie gebleken dat menselijk speeksel aangekocht bevat veel peptide fragmenten afkomstig van verschillende eiwitten. Bemonstering speeksel met LLUF sondes vermeden centrifugeren, maar effectief verwijderd veel groter en hoge overvloed eiwitten. Onze massaspectrometrische resultaten blijkt dat veel lage abundantie peptiden werden gedetecteerd na het uitfilteren van grotere eiwitten met LLUF sondes. Detectie van lage abundantie heeft speeksel peptiden was onafhankelijk van de verschillende voor-stap voorbeeld scheiding met chromatografie. Voor klinische toepassing, de LLUF sondes te nemend met LC-MS zou kunnen worden gebruikt in de toekomst progressie van de ziekte van speeksel te controleren.
Protocol
Discussion
Wij hebben gevonden dat veel peptide fragmenten bestaan menselijke onverteerd speeksel. Deze peptide fragmenten daarvan aan verschillende vormen van proline-rijke eiwitten, actine, alfa-amylase, alpha 1 globine, beta-globine, histain 1, keratine 1, mucine 7 polymère immunoglobuline receptor, satherin, S100A9. Er kunnen vele factoren de productie van peptiden met een onbepaald knipplaatsen. Bijvoorbeeld, sommige peptidefragmenten van nature aanwezig in humaan speeksel. Veel peptiden met-PQ C-termini vastgesteld <s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grants (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 en R21-I58002-01). Wij danken C. Niemeyer voor de kritische lezing van het manuscript.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
Riferimenti
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochimica. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
