Die Reinigung von Pathogen Vakuolen aus<em> Legionellen</em>-Infizierten Phagozyten
Summary
Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von intakten<em> Legionellen</em>-Haltigen Vakuolen (leichte Nutzfahrzeuge) von Amöben und Makrophagen. Das Zwei-Schritt-Protokoll umfasst LCV Anreicherung mittels Immuno-magnetische Trennung unter Verwendung eines Antikörpers gegen ein bakterielles LCV-Marker und weitere Reinigung durch Dichtegradientenzentrifugation.
Abstract
Die opportunistischen Erreger Legionella pneumophila ist eine Amöbe-resistentes Bakterium, das auch den Wiederholungen in Alveolarmakrophagen wodurch die schweren Lungenentzündung "Legionärskrankheit" ein. In Protozoen-und Säugetier-Phagozyten, L. pneumophila beschäftigt konservierten Mechanismus, um eine bestimmte, Replikations-permissive Fach, die "Legionellen-enthaltenden Vakuolen" (LCV) zu bilden. LCV Bildung erfordert die bakterielle Icm / Dot-Typ IV-Sekretionssystem (T4SS), was so viel wie 275 "Effektor" transloziert Proteine in Wirtszellen. Die Effektoren manipulieren Host-Proteinen sowie Lipide und kommunizieren mit sekretorischen, endosomalen Organellen und Mitochondrien-04.02.
Die Bildung von leichten Nutzfahrzeugen stellt eine komplexe, robuste und redundante Prozess, der nur schwer in einer reduktionistischen Weise zu erfassen ist. Ein integrativer Ansatz ist erforderlich, um umfassend zu verstehen LCV Bildung, einschließlich einer globalen Analyse Wegogen-Host-Faktor-Wechselwirkungen und ihre zeitliche und räumliche Dynamik. Als ein erster Schritt zu diesem Ziel werden intakte leichte Nutzfahrzeuge gereinigt und analysiert durch Proteomik und Lipidomik.
Die Zusammensetzung und die Bildung von Erreger-enthaltenden Vakuolen durch Proteom-Analyse durch Flüssigkeitschromatographie oder 2-D Gelelektrophorese gekoppelt Massenspektrometrie untersucht. Vakuolen entweder von der sozialen Amöbe Dictyostelium discoideum Boden oder Säugetier-Phagozyten isoliert hegte Leishmania 5, Listeria 6, 7 Mycobacterium, Rhodococcus 8, 9 oder Salmonella Legionella spp. 10. Allerdings sind die Aufreinigungsprotokolle in diesen Studien beschäftigt zeitraubend und langweilig, wie sie z. B. Elektronenmikroskopie zu LCV Morphologie, Integrität und Reinheit zu analysieren erfordern. Darüber hinaus müssen diese Protokolle nicht ausnutzen Besonderheiten des Erregers Vakuole für dereicherung.
Die hier vorgestellte Methode überwindet diese Einschränkungen durch den Einsatz von D. discoideum Herstellung eines fluoreszierenden Marker und LCV durch Targeting des bakteriellen Effektorprotein SidC, die selektiv Anker auf die LCV Membran durch Bindung an Phosphatidylinositol-4-phosphat (PtdIns (4) P) 3,11. LCV in einem ersten Schritt mittels Immuno-magnetische Trennung unter Verwendung eines affinitätsgereinigten primären Antikörper gegen SidC und einen sekundären Antikörper an magnetische Beads gekoppelt ist, in einem zweiten Schritt durch eine klassische Histodenz Dichtegradientenzentrifugation 12,13 (Abb. 1), gefolgt angereichert .
Ein Proteom-Studie von isolierten leichte Nutzfahrzeuge aus D. discoideum ergab mehr als 560 Wirtszellproteinen, einschließlich Proteine mit phagozytischen Vesikel, Mitochondrien, ER und Golgi, sowie mehrere GTPasen, die nicht in LCV Bildung wurden vor dem 13. beteiligt zugeordnet. LCV angereichert und gereinigt mit derProtokoll hier skizzierten kann durch Mikroskopie (Immunfluoreszenz, Elektronenmikroskopie), biochemischen Methoden (Western Blot) und Proteomik oder der Lipid Ansätze analysiert werden.
Protocol
Discussion
Im Gegensatz zu früher veröffentlichten Verfahren wird dieses Protokoll auf zwei Schritten, zuerst die Trennung von leichten Nutzfahrzeugen mit einem Immuno-magnetische Ansatz und zweiten, die Reinigung von leichten Nutzfahrzeugen durch Dichtegradientenzentrifugation bezogen. Die LCV Trennung kann durch Fluoreszenz-Mikroskopie, wenn entweder fluoreszenzmarkierten Bakterien und GFP-produzierenden Zellen oder Antikörper-Färbung verwendet wird, gefolgt werden. Das hier beschriebene Protokoll ist eine einfache, unkompli…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forschung in unserem Labor wurde von der Max von Pettenkofer-Institut, Ludwig-Maximilians-Universität München, der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, HALLO 1511/3-1) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) "Medical Infektion Genomics"-Initiative unterstützt ( 0315834C).
Riferimenti
- Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence. Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).
- Zhu, W. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS ONE. 6, e17638 (2011).
- Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella. Front Microbiol. 2, 91 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Kima, P. E., Dunn, W. Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles. Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).
- Lührmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).
- Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).
- Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage. Traffic. 6, 635-653 (2005).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).
- Shevchuk, O. Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium. Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).
- Brombacher, E. Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila. J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).
- Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 (2010).
- Urwyler, S. Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases. Traffic. 10, 76-87 (2009).
- Mampel, J. Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).
