癌における遺伝子機能を研究するDNAベクターベースのRNA干渉
Summary
RNA干渉（RNAi）は遺伝子ノックアウトよりも多くの利点を有し、広範に遺伝子機能研究のツールとして使用されています。 DNAベクターベースのRNAi技術の発明は、長期的および誘導性遺伝子のノックダウンを可能にした、また、遺伝子サイレンシングの可能性を増加している<emin vivoでの></em>。
Abstract
RNA干渉（RNAi）が特異的に分解する標的mRNAによる遺伝子発現を阻害する。遺伝子サイレンシング1の二本鎖の小さな干渉RNA（siRNA）の発見以来、RNAiは遺伝子機能の研究において強力な研究ツールとなっています。遺伝子欠失に比べて、RNAiによる遺伝子サイレンシングは、そのようなことが行われると使いやすさと、ほとんどの細胞株への適合性など多くの利点を持っています。複数の研究は癌研究でのRNAi技術の応用を実証した。特に、U6またはH1プロモーターにより駆動される小さなヘアピンRNA（shRNA）を生成するDNAベクターベースの技術の開発が可能2,3サイレン長期および誘導性遺伝子を行いました。このようなレンチウイルスなどの遺伝子組み換えウイルスベクターと組み合わせて、その使用は、安定したshRNA発現のためにゲノムDNAにshRNAの配信、および/または統合の高効率を容易にします。
我々はdetaileを記述するdの手順では、shRNAは、レンチウイルスの生産と細胞感染、マウス異種移植モデルを用いた機能研究を表現するレンチウイルスベクターの構築を含む、遺伝子機能を決定するDNAベクターベースのRNAi技術を使用します。
様々な戦略がshRNAコンストラクトを生成する際に報告されている。プロトコルは、PCR増幅を採用し、3断片ライゲーションが直接かつ効率的にshRNAをコードする配列に余分な塩基の隣接を離れることなく、レンチウイルスコンストラクトをshRNAを含む生成するために使用することができますここで説明する。この戦略によって作成されたshRNAの発現カセットを制限酵素によって切断することができるので、それらは容易に異なる蛍光または抗生物質マーカーを有する他のベクターに移動することができます。ほとんどの市販のトランスフェクション試薬は、レンチウイルス生産に使用することができます。しかし、このレポートでは、我々は90％のトランスフェクション効率を上に実現することができますリン酸カルシウム沈殿を用いた経済的な方法を提供する293T細胞。構成のshRNA発現ベクターに比べ、誘導性のshRNAシステムは、細胞増殖に必須の遺伝子をノックダウンに特に適しています。我々は、陰陽1（YY1）、TETオン誘導shRNAのシステムおよび腫瘍形成に及ぼす影響によって乳癌4,5、の潜在的な癌遺伝子の遺伝子サイレンシングを示しています。レンチウイルスを用いた研究は、研究者の所属機関のバイオセーフティ委員会によるバイオプロトコルのレビューと承認を必要とします。動物モデルを用いた研究では、アニマルケア、動物プロトコルのレビューと承認を必要とし、研究者の機関の委員会（ACUC）を使用します。
Protocol
Discussion
このプロトコルは、shRNAを用いて遺伝子をノックダウンし、in vivoでの腫瘍細胞増殖の生物発光イメージングを使用して、その生物学的効果を可視化する方法について説明します。shRNAのターゲットサイトが使用される3つの制限部位のいずれか（をBamHI、HindIII及びEcoRI）を含めるべきではありませんサブクローニングのために。以下のいずれのサイトが存在するときにまれなシナ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、研究Scholarのアメリカの癌協会からの補助金（116403-RSG-09から082-01-MGO）とGSのウェイクフォレスト大学健康科学の学内資金によって部分的にサポートされていました。 DBSは、NCI訓練助成金5T32CA079448によってサポートされていました。
Materials
In addition to common laboratory equipment used for RNA and protein analyses and cell culture, the following materials and reagents are required for this protocol.
| Name of the reagent |
| Biosafety Cabinet suitable for Biosafety Level 2 containment |
| PCR thermocycler |
| Ultracentrifuge |
| Anesthesia-induction chamber with isoflurane scavengers |
| Digital Vernier caliper |
| IVIS imaging system |
| Highly competent DH5a E. coli |
| EcoRI, BamHI, & HindIII restriction enzymes |
| T4 DNA Ligase |
| Third generation lentivirus packaging plasmids VSV-G, pRSV-Rev and pMDLg/pRRE |
Materials List
Riferimenti
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