intracellular, cytoplasmic पूर्ण सेल संस्कृतियों से लंबाई DISC1 प्रोटीन aggresomes और एक लेबल, multimeric रीकॉम्बीनैंट DISC1 प्रोटीन में टुकड़ा के उत्पादन, शोधन, और सेल आक्रमण<em> ई. कोलाई</em> वर्णित हैं. सेल invasiveness प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के लिए सेल संस्कृति में और न्यूरॉन्स के लिए दिखाया गया है<em> Vivo में</em> Stereotactical मस्तिष्क टीका के बाद.
Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer’s disease (Aβ, tau), Parkinson’s Disease (α-synuclein), Huntington’s disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for Aβ6, tau7-9, α-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic α-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.
इस अध्ययन में हम एक ट्रांसफ़ेक्ट neuroblastoma सेल लाइन, तैयारी और एक रीकॉम्बीनैंट DISC1 प्रोटीन प्रजातियों की लेबलिंग और इन विट्रो में और vivo में प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के सेल आक्रमण प्रयोगों में उनके आवेदन से mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes की शुद्धि का वर्णन करता है.
देशी mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes की शुद्धि प्रोटोकॉल से विकसित किया गया था Lewy शरीर संरचनाओं की तरह और बड़े समुच्चय 13, 14 को अलग करने के लिए, लेकिन डिटर्जेंट के उपयोग से बचने के लिए और झूठी सकारात्मक सेल आक्रमण का खतरा है कि हो सकता है कम से कम करने के लिए संशोधित डिटर्जेंट सुगम बनाया झिल्ली प्रवेश करने के लिए कारण.
एक संभव भविष्य में सुधार के लिए आगे aggresomes से पूरी तरह से अलग शेष झिल्ली और cytoskeleton sonication द्वारा aggresomes की शुद्धता को बढ़ाने में हो सकता है. बढ़ती समग्र पवित्रता, कुल आक्रमण घटनाओं की संख्या है कि बड़े aggresomes माँ के लिए दर्जy 5 वृद्धि हुई है. क्या हमारे सुझाए sucrose 3-चरण की सीमित परिभाषा अन्य प्रोटीन प्रजाति के aggresomes के लिए पर्याप्त है के लिए परीक्षण किया जा सकता है, इस अर्थ में प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित व्यक्तिगत अनुकूलन के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में माना जाना चाहिए. शुद्ध aggresomes हमारे हाथ, अतिरिक्त धोने कदम (डिटर्जेंट) के बिना कुल उपज काफी कम sucrose के निशान को खत्म करने में काफी मजबूत साबित हुई.
हम पिछले एक प्रकाशन में वर्णित है कि DISC1 की oligomer विधानसभा 4 सी टर्मिनस (4 चित्रा) में अलग multimerization डोमेन पर निर्भर है. हम ई. में पुनः संयोजक घुलनशील अभिव्यक्ति के लिए इस टुकड़ा चुना कोलाई और बाद में और नी NTA शुद्धि. अपने multimerization की निगरानी करने और α-synuclein प्रोटीन कोशिका की तरह आक्रामक के साथ अपने सेल invasiveness की तुलना करने के लिए, हम साथ फ्लोरोसेंट डाई DyLight594 DISC1 (598-785) लेबल, और की तुलना में अपनीसमान रूप से लेबल α synuclein का उस के साथ सेल invasiveness. रीकॉम्बीनैंट DISC1 टुकड़ा की सेल invasiveness देशी, पूर्ण DISC1 aggresomes लंबाई, अपने छोटे आकार और बहुत उच्च शुद्धता के कारण होने की संभावना की है कि तुलना में नाटकीय रूप से वृद्धि हुई थी. फिर, शुद्धता के लिए सेल invasiveness में एक निर्णायक भूमिका निभा रहा है.
हमारे उदाहरण में आक्रामक aggresomes लक्ष्य सेल लाइन के घुलनशील सजात प्रोटीन है कि recombinantly एक घुलनशील, यानी फार्म सेल छितरी हुई में व्यक्त किया गया था भर्ती किया था. प्राप्तकर्ता सेल लाइन में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे GFP या आरएफपी) की अभिव्यक्ति एक फायदा है क्योंकि यह प्राप्तकर्ता सेल सीमा के भीतर आक्रामक aggresomes और पुनः संयोजक प्रोटीन के Z-ढेर इमेजिंग के माध्यम से colocalization की अनुमति देता है.
सेल इनवेसिव DISC1 aggresomes और multimeric टुकड़े व्यक्त की और ई. से शुद्ध कोलाई एक प्रोटीन गठनात्मक DISC1, डि से संबंधित रोगों की एक विशेषता परिभाषित किया जा सकता है15 SC1opathies.
मुसीबत शूटिंग:
Sucrose ढाल शुद्धि के बाद कम aggresome उपज:
sucrose इस प्रोटोकॉल में शुरू ढाल eGFP/mRFP-DISC1 aggresomes (FL) के साथ अच्छी तरह से काम करता है. अन्य प्रोटीन से मिलकर Aggresomes चर आयामों की हो इसलिए sucrose सांद्रता अन्य उपयोगकर्ताओं के द्वारा अनुकूलित किया जाना चाहिए सकता है.
पुनः संयोजक प्रोटीन की अपर्याप्त शुद्धिकरण:
पुनः संयोजक प्रोटीन की शोधन प्रक्रिया में किसी भी बैक्टीरिया contaminants भी प्रोटोकॉल के बाद के चरणों में लेबल किया जाएगा. Contaminations से बचने के लिए, एक एसडीएस पृष्ठ पर प्रोटीन को चलाने के लिए और पुष्टि करते हैं कि प्रोटीन रीकॉम्बीनैंट Coomassie ब्लू के साथ धुंधला करके कम से कम 95% है शुद्ध. उच्चतम गुणवत्ता और उपज सुनिश्चित करने के लिए, प्रोटोकॉल के लिए प्रत्येक व्यक्ति के प्रोटीन के लिए अनुकूलित किया जाना है.
कम लेबलिंग एफईपुनः संयोजक प्रोटीन की ficiency:
कोई contaminations है कि मुक्त एसएच समूहों शामिल प्रोटीन की कुशल लेबलिंग में कमी होगी. इसलिए, व्यापक डायलिसिस और नी NTA आधारित शुद्धि अनिवार्य है.
The authors have nothing to disclose.
यह काम न्यूरॉन Eranet डिस्कवर (01EW1003 BMBF) सी.के. और JPH, DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) के लिए वित्त पोषित किया गया था CKVB डसेलडोर्फ के विश्वविद्यालय के मेडिकल संकाय के Forschungskommission की एक अनुदान द्वारा समर्थित है.
Reagent name | Company | Catalog number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | Medium is dependent on the host cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMEM/F-12 | Invitrogen | 11320-033 | Medium is dependent on the recipient cell line. The optimal recipient cell line should be determined by the user. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PBS | Invitrogen | 14190-250 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafectene | Biontex | T020-1.0 | Other transfection reagents might work as well but were not tested with our protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | The experiments were done with Ni_NTA agarose from Qiagen, other suppliers should work as well. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I | Roche | 04716728001 | There is no need for RNase free DNase in the process of aggresomes purification. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | Serum-free medium works as well | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | Supplement for SH-SY5Y and NLF medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Non-essential-amino-acids (NEAA) | Sigma-Aldrich | M7145 | Supplement for SH-SY5Y medium | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Trypan Blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | Toxic reagent | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DyLight 594 Maleimide | Thermo-Fisher Scientific | 46608 | Reduced cysteine reactive dye to form stable thioether bonds. Also available in other colors. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ProLong Gold with DAPI | Invitrogen | P36935 | This antifade liquid mountant gave superior results in our hands. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve 1 table in 500 μl H2O for 100X solution. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Synthetic a-synuclein | Sigma | S7820 | Refold as described in text. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table of specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Precellys 24 | Bertin Technologies | 03119.200.RD000 | We have not tested other mechanical homogenizers other than this. Other detergent free homogenization method might work as well, but have not been tested for this protocol. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5301 Concentrator (speedvac) | Eppendorf | 5301 000.210 | Only necessary if protein has to be concentrated. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LSM 510 and Axiovision Apotome2 | Zeiss | See manufacturers catalog | Both microscopes harbor the ability to perform Z-stack imaging. This is a prerequisite for solid and serious evaluation of invasion events. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cell culture plastic material | Nunc | 10 cm dishes #172958, 24-well plates #142475 | The use of different plastic material might influence the interaction of recombinant proteins or aggresomes and the plastic surfaces. We have not tested materials other than the ones described here. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table of specific material and equipment. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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