배아 Murine 신경 튜브에서 신경 크레스트 세포의 분리 및 문화
Summary
신경 튜브의 배아 신경 능선의 분리가의 사용을 용이하게<em> 체외에서</em> 마이 그 레이션, 자동 갱신, 그리고 신경 능선의 multipotency를 공부를위한 방법.
Abstract
배아 신경 능선 (NC)는 신경 튜브 등의 측면에서 유래 multipotent 전구 인구 mesenchymal 전이 (EMT)로 상피를 겪습 다양한 세포 유형에 1-3로 상승을주는, 태아에 걸쳐 마이 그 레이션합니다. NC는 또한 표적 장기 4-6의 분화와 성숙에 영향을주는 독특한 능력이있다. 체외에서 explanted 때, 노스캐롤라이나의 progenitors 자기 갱신을 받다, 마이 그 레이션과 뉴런, glia, 평활근 세포, 연골 및 뼈 포함하여 조직 유형의 다양한으로 차별화.
NC의 multipotency 처음. 조류 신경 튜브 7-9의 explants에서 설명한 NC 세포의 체외 절연에서 증식, 이주 및 multipotency 포함하여 노스캐롤라이나 역학 연구를 용이하게되었다. 조류 및 쥐의 시스템의 추가 작업은 배아 10에 다시 이식하면 explanted 노스캐롤라이나 세포들이 노스캐롤라이나 잠재력을 유지 것을 증명-13. 이러한 고유 셀룰러 속성 explanted NC의 progenitors에 보존되기 때문에 신경 튜브 explant 분석은 체외에서 노스캐롤라이나를 공부를위한 매력적인 옵션을 제공합니다.
포유류의 노스캐롤라이나의 더 나은 이해를 달성하기 위해 여러 방법은 NC의 인구를 분리하기 위해 고용되었다. NC-파생 progenitors이 포스트 철새 NC의 progenitors 11,14-20의 역학을 연구하는 배아와 성인 모두에서 사후 철새 위치에서 배양해 수있다 그러나 그들은 신경 튜브에서 이민으로 노스캐롤라이나의 progenitors의 고립은 최적의 보존을 제공 NC 잠재력 전지 및 철새 속성 13,21,22. 일부 프로토콜은 특정 progenitors 11,13,14,17위한 풍부한 NC 인구를 분리하는 형광 활성화된 셀 정렬 (FACS) 채용. 그러나, 초기 단계의 배아로 시작하는 경우, 분석을위한 적절한 셀 번호는 초기 노스캐롤라 populatio의 절연 복잡 FACS로 취득하기가 어렵습니다각각의 배아에서 NS. 여기서는 Wnt1-Cre 활성화 혈통 기자 23 일 기준으로 약 96% 순수 노스캐롤라이나 인구에 FACS 및 결과에 의존하지 않는 방식을 설명합니다.
여기에 제시된 방법은 쥐의 노스캐롤라 11,13의 문화에 최적화된 프로토콜에서 적응하고 있습니다. 이 프로토콜 이전 방법에 비해의 장점은 1) 세포는 FACS)가) 비교적 순수한 노스캐롤라이나 인구, 3을 얻기 위해 필요하지 않습니다 premigratory 노스캐롤라이나 세포가 격리되고 4) 피더 레이어 2에서 재배되지 않는 결과를 쉽게임을 있습니다 계량. 또한이 프로토콜은 서로 다른 유전자 조작과 노스캐롤라이나 특성의 학습을 촉진, 모든 돌연변이 마우스 모델에서 NC의 분리에 사용될 수 있습니다. 이 방법의 한계는 노스캐롤라이 노스캐롤라이나 2,24-28의 생존, 이주 및 분화에 영향을 미치는 것으로 알려져 배아의 맥락에서 제거되는 것입니다.
Protocol
Discussion
주의이 방법의 성공을 보장하기 위해 태아의 발달 단계에 납부하여야한다. 초기 마우스 배아의 somites을 계산하는 것은 쓰레기 내에서 배아와 일치하고 격리를 위해 신경 튜브의 정확한 영역을 결정하는 단계에 대해 모두 중요합니다. 배아 사이에 하나 또는 두 개의 somites의 변형 실시한 실험의 해상도에 따라 개발시기의 합리적인 범위 내에 있습니다. 9 9.5 dpc 사이의 태아 17 및 25 somites 사이가됩?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 비디오 지원 마크 워즈 니 악을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 culturing 쥐 NC 세포의 원래 프로토콜 UT 남서에서 숀 모리슨을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 밴더빌트 대학 메디컬 센터 아카데미 프로그램 지원을 지원하고 NIH (HD36720과 HD036720-11S109)와 PAL에 AHA 11GRNT7690040 남구로 AHA (0615209B)와 NIH (NS065604)에서 predoctoral 장학금 및 ERP에서 교부금에 의해 있었다 NIH 연수 보조금 T32HD007502에 의해 지원.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM (low glucose) | Gibco/Invitrogen | 11885 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103 | |
| BSA | Sigma | A3912-10G | |
| dPBS | Gibco | 14190-144 | |
| IGF1 | BD Biosciences | 354037 | Store in 50 μg/mL aliquots at -20°C. |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | Store in 25 μg/mL aliquots at -20°C. |
| Fibronectin | Gibco | 33016-015 | Stored in 1mg/mL aliquots at -20°C. |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Store in 35 μg/ml aliquots after reconstituting in ethanol at -20°C. |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | D-5637 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Steriflip 0.22 μm filters | Millipore | SCGP00525 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| 0.20 μm filters | Corning | 431219 | |
| Syringes (for filtration) | BD Biosciences | 301604 | |
| Four well plates | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 269 638 | Activity varies by batch. Store in 100 mg/mL aliquots at -20°C. |
| Insulin needles (29½ gage) |
Becton Dickson | 309306 | |
| Hypoxia Chamber | Billups-Rothenberg | ||
| Oxygen Analyzer | Billups-Rothenberg | ||
| Forceps #5 | Fine Science Tools | For removing uterus and decidua. | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200 |
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