Summary

Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

Published: June 02, 2012
doi:

Summary

Aislamiento de cresta neural embrionario del tubo neural facilita el uso de<em> In vitro</em> Métodos para el estudio de la migración, la auto-renovación, y multipotencia de la cresta neural.

Abstract

El embrión de la cresta neural (NC) es una población de progenitores multipotentes que se origina en la cara dorsal del tubo neural, se somete a un epiteliales de transición mesénquima (TEM) y migra a través del embrión, dando lugar a diversos tipos de células de 1-3. CN también tiene la capacidad única para influir en la diferenciación y maduración de los órganos diana 4-6. Cuando explantado in vitro, los progenitores NC someterse a la auto-renovación, migrar y diferenciarse en una variedad de tipos de tejidos incluyendo las neuronas y células gliales, células del músculo liso, cartílago y hueso.

Multipotencia Carolina del Norte fue descrita por primera vez a partir de explantes del tubo neural aviar 7-9. En el aislamiento in vitro de células NC facilita el estudio de la dinámica de Carolina del Norte, incluyendo la proliferación, migración y multipotencia. Seguir trabajando en los sistemas de aves y ratas demostraron que las células explantados NC conservar su potencial de Carolina del Norte cuando se trasplantan de nuevo en el embrión de 10-13. Debido a estas propiedades inherentes celulares se conservan en explantados progenitores NC, el tubo de ensayo explante neuronal proporciona una opción atractiva para el estudio de la NC in vitro.

Para lograr una mejor comprensión de los mamíferos NC, muchos métodos han sido empleados para aislar poblaciones NC. NC-derivados de los progenitores puede ser cultivado a partir de post-migratorias lugares, tanto en el embrión y el adulto para estudiar la dinámica de la post-migratorias progenitores NC 11,14-20, sin embargo el aislamiento de progenitores de Carolina del Norte, ya que emigran del tubo neural proporciona una conservación óptima de NC potencial de la pila y propiedades migratorias 13,21,22. Algunos protocolos emplear fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) para aislar una población NC enriquecido para progenitores particulares 11,13,14,17. Sin embargo, cuando se inicia con embriones en fase inicial, el número de células adecuadas para el análisis son difíciles de obtener con FACS, lo que complica el aislamiento de principios populatio NCns a partir de embriones individuales. A continuación, describimos un método que no depende de la FACS y los resultados en una población de aproximadamente el 96% pura Carolina del Norte sobre la base de un reportero Wnt1-Cre activado linaje 23.

El método que aquí se presenta es una adaptación de los protocolos optimizados para el cultivo de ratas NC 11,13. Las ventajas de este protocolo en comparación con los métodos anteriores son que: 1) las células no se cultivan en una capa alimentadora, 2) FACS no se requiere para obtener una población NC relativamente puro, 3) premigratorias células aisladas se NC y 4) resultados son fácilmente cuantificados. Además, este protocolo se puede utilizar para el aislamiento de NC de cualquier modelo de ratón mutante, lo que facilita el estudio de las características de NC con diferentes manipulaciones genéticas. La limitación de este enfoque es que el CN se retira del contexto del embrión, que se sabe que influyen en la supervivencia, la migración y la diferenciación del CN 2,24-28.

Protocol

1. Preparación de las placas Utilizar una técnica estéril en todo momento. Preparar fibronectina (FN) por dilución de 100 l de plasma humano de stock FN en un volumen final de 3,3 ml en PBS de Dulbecco (DPBS). La concentración final es de 30 mcg / ml y esto se puede almacenar a 4 ° C durante 1 semana. Cubrir el fondo de cada pocillo de una cultura estéril del tejido cuatro pocillos con solución de FN y deje reposar durante 15 minutos. Asegúrese de que toda la superficie está cubi…

Discussion

Debe prestarse cuidadosa atención a la etapa de desarrollo del embrión para asegurar el éxito de este enfoque. Contando somitos de embriones tempranos de ratón es fundamental tanto para la etapa correspondiente embriones dentro de una camada y la determinación de las regiones correctas del tubo neural para el aislamiento. Una variación de uno o dos somitas entre embriones está dentro de una gama razonable de tiempo de desarrollo, dependiendo de la resolución del experimento llevado a cabo. Un embrión entre el 9…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer a Marc Wozniak para la asistencia de vídeo. También queremos agradecer a Sean Morrison de UT Southwestern para el protocolo original para el cultivo de células de rata NC. Este trabajo fue apoyado Vanderbilt University Medical Centro de Soporte del Programa Académico y fue por las subvenciones del NIH (HD36720 y HD036720 11S109-) y la AHA 11GRNT7690040 a PAL, las becas predoctorales de la AHA (0615209B) y el NIH (NS065604) a Nam, y el ERP con el apoyo de una formación T32HD007502 NIH subvención.

Materials

Reagent Company Catalogue number Comments
DMEM (low glucose) Gibco/Invitrogen 11885  
Neurobasal Medium Gibco 21103  
BSA Sigma A3912-10G  
dPBS Gibco 14190-144  
IGF1 BD Biosciences 354037 Store in 50 μg/mL aliquots at -20°C.
bFGF BD Biosciences 354060 Store in 25 μg/mL aliquots at -20°C.
Fibronectin Gibco 33016-015 Stored in 1mg/mL aliquots at -20°C.
Retinoic acid Sigma R2625 Store in 35 μg/ml aliquots after reconstituting in ethanol at -20°C.
2-mercaptoethanol Sigma D-5637  
N2 supplement Gibco 17502-048  
B27 supplement Gibco 17504-044  
Steriflip 0.22 μm filters Millipore SCGP00525  
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140122  
0.20 μm filters Corning 431219  
Syringes (for filtration) BD Biosciences 301604  
Four well plates Thermo Fisher Scientific 176740  
Collagenase/Dispase Roche 269 638 Activity varies by batch. Store in 100 mg/mL aliquots at -20°C.
Insulin needles
(29½ gage)
Becton Dickson 309306  
Hypoxia Chamber Billups-Rothenberg    
Oxygen Analyzer Billups-Rothenberg    
Forceps #5 Fine Science Tools   For removing uterus and decidua.
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200  

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube. J. Vis. Exp. (64), e4134, doi:10.3791/4134 (2012).

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