Isolering og kultur neural crest Celler fra Embryonic murin Neural Tube

Summary

Isolering av embryonale neural crest fra nevralrøret forenkler bruken av<em> In vitro</em> Metoder for å studere migrasjon, selvfornyelse, og multipotency av neural crest.

Abstract

Den embryonale neural crest (NC) er en multipotent stamfar befolkning som stammer ved dorsal del av nevralrøret, gjennomgår en epitelial til mesenchymale overgang (EMT) og vandrer hele embryoet, som gir opphav til ulike celletyper ^1-3. NC har også en unik evne til å påvirke differensiering og modning av målorganer ^4-6. Når eksplantert in vitro, NC stamfedre gjennomgå selvfornyelse, vandrer og skille ut en rekke vevstyper inkludert nerveceller og gliaceller, glatte muskelceller, brusk og bein.

NC multipotency ble først beskrevet fra explants av luftfarten nevralrøret ^7-9. In vitro isolering av NC celler letter studiet av NC dynamikk, inkludert spredning, migrasjon, og multipotency. Videre arbeid i luftfarten og rotte systemer vist at eksplanterte NC cellene beholder sin NC potensial når transplantert tilbake til fosteret ¹⁰-13. Fordi disse iboende cellulære egenskapene er bevart i eksplanterte NC stamfedre, gir nevralrøret eksplantering analysen et attraktivt alternativ for å studere NC in vitro.

For å oppnå en bedre forståelse av pattedyr NC har mange metoder blitt ansatt for å isolere NC populasjoner. NC-deriverte stamfedre kan dyrkes fra post-trekkende steder i både embryo og voksne til å studere dynamikken i post-trekkende NC stamfedre ^11,14-20 imidlertid isolering av NC stamfedre som de emigrere fra nevralrøret gir optimal bevaring av NC celle potensiale og trekkende egenskaper ^13,21,22. Enkelte protokoller benytter fluorescens aktivert celle sortering (FACS) å isolere en NC befolkning beriket for bestemte stamfedre ^11,13,14,17. Men når du starter med tidlig stadium embryoer, celle tall tilstrekkelige for analyser er vanskelig å få med FACS, kompliserer isolering av tidlig NC populations fra individuelle embryo. Her beskriver vi en tilnærming som ikke er avhengig FACS og resultater i en ca 96% ren NC befolkningen basert på en Wnt1-Cre aktivert avstamning reporter ^23.

Metoden som presenteres her er tilpasset fra protokoller optimalisert for kulturen i rotte NC ^11,13. Fordelene med denne protokollen i forhold til tidligere metoder er at 1) cellene ikke er dyrket på en mater lag, 2) FACS er ikke påkrevd for å oppnå en relativt ren NC befolkning, 3) premigratory NC cellene er isolert og 4) resultatene er lett kvantifisert. Videre kan denne protokollen brukes til isolering av NC fra noen mutant mus modell, tilrettelegge studiet av NC egenskaper med ulike genetiske manipulasjoner. Begrensningen av denne tilnærmingen er at NC er fjernet fra rammen av embryo, som er kjent for å påvirke overlevelse, migrasjon og differensiering av NC ^2,24-28.

Protocol

1. Forbereder Plater Bruk steril teknikk til alle tider. Forbered fibronectin (FN) ved å fortynne 100 mL av humant plasma FN lager til en endelig volum på 3,3 ml i Dulbecco sin PBS (dPBS). Endelig konsentrasjon er 30 mikrogram / ml og dette kan lagres ved 4 ° C i 1 uke. Dekk bunnen av hver brønn av en steril vevskultur fire godt plate med FN-løsning og la sitte i 15 minutter. Sørg for at hele overflaten er dekket. Gjør media i løpet av denne tiden (trinn 2 og 3). Fjern Fn…

Discussion

Nøye oppmerksomhet bør rettes mot utviklingsstadiet av embryo for å sikre suksess for denne tilnærmingen. Telle somites av tidlige mus embryoer er kritisk både for scene matching embryo innenfor et kull og bestemme de riktige delene av nevralrøret for isolasjon. En variant av en eller to somites mellom embryoer er innen rimelig rekkevidde av utviklingsmessige timing, avhengig av oppløsningen av forsøket gjennomført. Et embryo mellom 9 og 9,5 DPC vil ha mellom 17 og 25 somites. Hvis fosteret har mer enn 25 somit…

Materials

Reagent	Company	Catalogue number	Comments
DMEM (low glucose)	Gibco/Invitrogen	11885
Neurobasal Medium	Gibco	21103
BSA	Sigma	A3912-10G
dPBS	Gibco	14190-144
IGF1	BD Biosciences	354037	Store in 50 μg/mL aliquots at -20°C.
bFGF	BD Biosciences	354060	Store in 25 μg/mL aliquots at -20°C.
Fibronectin	Gibco	33016-015	Stored in 1mg/mL aliquots at -20°C.
Retinoic acid	Sigma	R2625	Store in 35 μg/ml aliquots after reconstituting in ethanol at -20°C.
2-mercaptoethanol	Sigma	D-5637
N2 supplement	Gibco	17502-048
B27 supplement	Gibco	17504-044
Steriflip 0.22 μm filters	Millipore	SCGP00525
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140122
0.20 μm filters	Corning	431219
Syringes (for filtration)	BD Biosciences	301604
Four well plates	Thermo Fisher Scientific	176740
Collagenase/Dispase	Roche	269 638	Activity varies by batch. Store in 100 mg/mL aliquots at -20°C.
Insulin needles (29½ gage)	Becton Dickson	309306
Hypoxia Chamber	Billups-Rothenberg
Oxygen Analyzer	Billups-Rothenberg
Forceps #5	Fine Science Tools		For removing uterus and decidua.
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200