Мышь Островок Лангерганса изоляции с использованием комбинации Очищенный коллагеназы и нейтральной протеазы

Summary

Подробное описание изоляции мыши островка описывается с помощью техники на месте панкреатического протоков катетеризации и перфузии сочетание очищенной коллагеназы и нейтральной протеазы.

Abstract

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines to the study of isolated rodent islets. Primary islets offer the distinct advantage that they more faithfully reflect the biology of intracellular signaling pathways and secretory responses. Whereas the method of islet isolation using tissue dissociating enzyme (TDE) preparations has been well established in many laboratories^1-4, variations in the consistency of islet yield and quality from any given rodent strain limit the extent and feasibility of primary islet studies. These variations often occur as a result of the crude partially purified TDEs used in the islet isolation procedure; TDEs frequently exhibit lot-to-lot variations in activity and often require adjustments to the dose of enzyme used. A small number of reports have used purified TDEs for rodent cell isolations^{5, 6}, but the practice is not widespread despite the routine use and advantages of purified TDEs for human islet isolations. In collaboration with VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), we developed a modified mouse islet isolation protocol based on that described by Gotoh^{7, 8}, in which the TDEs are perfused directly into the pancreatic duct of mice, followed by crude tissue fractionation through a Histopaque gradient⁹, and isolation of purified islets. A significant difference in our protocol is the use of purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) combination. The collagenase was characterized by the use of a⁶ fluorescence collagen degrading activity (CDA) assay that utilized fluorescently labeled soluble calf skin fibrils as substrate⁶. This substrate is more predictive of the kinetics of collagen degradation in the tissue matrix because it relies on native collagen as the substrate. The protease was characterized with a sensitive fluorescent kinetic assay¹⁰. Utilizing these improved assays along with more traditional biochemical analysis enable the TDE to be manufactured more consistently, leading to improved performance consistency between lots. The protocol described in here was optimized for maximal islet yield and optimal islet morphology using C57BL/6 mice. During the development of this protocol, several combinations of collagenase and neutral proteases were evaluated at different concentrations, and the final ratio of collagenase:neutral protease of 35:10 represents enzyme performance comparable to Sigma Type XI. Because significant variability in average islet yields from different strains of rats and mice have been reported, additional modifications of the TDE composition should be made to improve the yield and quality of islets recovered from different species and strains.

Protocol

А. Необходимые материалы: см. Таблицу 1 (реагентов) до подготовки HBSS (P / S): 100 мл 10X HBSS + 900 мл H 2 0 + 1% пенициллина / стрептомицина (хранится в холодильнике или хранить на льду). 20% BSA складе производится в воде и на аликвоты и хранили при температуре -20 ° C. HBSS (BSA): 200 мл 1X HBSS (P / S) + 3 мл 20% BSA (конечная концентрация БСА составляет 0,3%) Островок среде: RPMI + 10% FBS + 1% глутамина + 1% пенициллина / стрептомицина Histopaque 1100: 240 мл 1119 Histopaque + 200 мл 1077 Histopaque 4-0 швов (McKesson): разрезать на 2 ¾ дюйма штук и хранится в 10 см блюдо Петри Инструменты: Согните щипцы из изобразительных инструментов науки до 90 °, и спиливать зубов зубчатых всех трех пар щипцов. Цель состоит в том, чтобы притупить зубы, чтобы не удалить их. Канюля для введения коллагеназы / протеазы смеси: 27G ½ дюйма иглы, 30 ½ дюймаиглу, PE50 трубки разрезают на 12 дюймов штук. Файл обе иглы до гладкого закругленным концом, который не имеет острых краев. Вставьте 27G иглу в один конец 12 дюймов кусок трубы PE50. Снимите 30G иглу из корпуса, разбив корпус с плоскогубцами, превратив корпус ¼ оборота каждый раз. Снимите иглу с плоскогубцами из корпуса и вставить его в другой конец трубы PE50 под микроскопом рассечение. Будьте уверены, чтобы не перегибать трубки, как вы вставить иглу в PE50 труб. 27G игла конце концов, что вы приложите шприц коллагеназы. Коллагеназы (CI фермента MA) и нейтральные протеазы (CI фермента BP). Развести TDE в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Обратитесь к определенной партии сертификат анализа для расчета концентрации фермента деятельности. Переезд в общей сложности 350000 коллагена унижающие деятельности (CDA) единиц восстановленной коллагеназы и 100.000 единиц нейтральной протеазы reconstitраспределенными протеазы BP в конической трубе и разбавить до 15 мл Всего в HBSS (P / S) В. Шаг за шагом протокола 1. Инфляция поджелудочной железы с коллагеназы / протеазы смеси Усыпить мышей путем смещения шейных позвонков, насыщают мыши туловища с 70% этанола, открытой брюшной полости полностью от ануса до диафрагмы с любым рассечение ножницами и щипцами. Наведите на платформе рассечение микроскопом. Потяните слепой и восходящей ободочной кишки, и установить их за пределами полости тела с левой стороны. См. рисунок 1 для резюме следующие шаги. Установите долей печени от диафрагмы, они должны остаться там, если полость тела открыта достаточно далеко. Найти печеночной артерии, воротной вены и желчных протоков расслоение, ведущие в печени путем захвата двенадцатиперстной кишки с изогнутым пинцетом. С другой паре изогнутые щипцы, достигают в артерии, вены, и канал буndle и вытащить 2 ¾ дюйма кусок 4-0 шва под артерии, вены, желчных протоков и связать его один раз и вытащить его туго как можно ближе к печени, как это возможно. Использование двух пар изогнутых щипцов, тщательно захватить двенадцатиперстной кишки и найти желчных протоков прикреплены к двенадцатиперстной кишке в сосочка. Используйте щипцы из щипцов, чтобы ткнуть через поджелудочной железы и соединительной ткани правого под пристальным желчных протоков в сосочка. Ткните щипцы быстро через орган, чтобы сделать отверстие, а затем положить обе щипцы щипцы до конца и захватить еще 2 ¾ дюйма кусок шва через 4-0 и связать его один раз и вытащите его в узком кругу, но не тянуть туго. Изменения к 90 ° щипцы и ножницы Superfine Vannas. С 90-щипцы °, тщательно щипать и тянуть тонкую кишку, пока желчных протоков натянута. Сделайте один горизонтальный разрез через сосочек с ножницами, нанося удар открытой ножницами в кишечник, а затем резки с одной движения. Попробуйте сделать только опе пересек сосочка без выбивании желчных протоков от сосочка. В то время как все еще держа в кишечнике с 90 щипцами °, вставьте канюлю в желчных протоках до половины длины желчных протоков, а затем осторожно потяните нить туго вокруг канюли. Заполнить 3 мл шприц с 2,0 мл коллагеназы / протеазы смеси и ввести в канюлю на медленное, постоянное темпами. После инфляция поджелудочной железы завершена, удалите канюлю из желчных протоков и использовать изогнутый пинцет и изогнутые ножницы весной, чтобы удалить завышенным поджелудочной железы, начиная с нисходящей ободочной кишки и отрезая соединительной ткани, как вы потяните вверх кишечника. Продолжить для удаления поджелудочной железы из кишечника, пока не достигнете желчных протоков, а затем удалить поджелудочную железу из селезенки, а затем в желудок, а затем из внутренних органов брюшной полости. Готово удаления от отрезая от швов. Добавить поджелудочной железы в 50 мл пробирку, содержащую 5 мл HBSS(P / S). Эта трубка должна быть на льду. Повторите описанную выше процедуру для каждого животного до четырех животных. Для получения оптимальных результатов, диссоциируют только четыре pancreata в одно время. Как правило, в то время как первые четыре находятся в 37 ° С водяной бане, мы раздувать еще четыре pancreata. 2. Поджелудочная железа Диссоциация Поместите 50 мл пробирки, содержащие pancreata в 37 ° С водяной бане в течение 15 мин. Осторожно покачайте трубу и проверить его на ткань диссоциации, убедитесь, что ткань ломается легко, то вихревой трубы 12 раз, а вы держите трубку на крышке. Добавить не более 30 мл HBSS (BSA) (это может быть ниже суммы, в зависимости от того, сколько требуется, чтобы сбалансировать труб для центрифугирования), и центрифуги при 290 х г в течение одной минуты. Супернатант тщательно и оставить небольшое количество супернатанта (2-3 мл) в нижней части таким образом, чтобы не нарушать клеточный осадок. С помощью 30 мл шприца АТТАКHed к 14G игла, добавить не более 10 мл HBSS (BSA) и аспирации подвески вверх и вниз 2 раза. Фильтр смесь клеток с помощью пластиковых ситечко в 50 мл трубки и промыть еще 10 мл HBSS (BSA). Центрифуга при 330 мкг в течение 2 мин. Слейте супернатант и инвертировать трубы для слива на абсорбирующие бумажное полотенце в течение 1 мин. Ресуспендируют каждой трубы в 10 мл холодного 1100 Histopaque. Перекрытие Histopaque с 10 мл HBSS (BSA) и центрифугируют при 900 х г в течение 18 мин. Удалите все 20 мл супернатанта использованием большого диаметра 25 мл пипетки и передать супернатанта через перевернутый 70 мкм фильтр. Промойте островков в 10 см блюдо Петри с помощью пипетки 10 мл средства массовой информации островок через фильтр, удерживая ее правой стороной вверх на блюдо. Культура островков в 37 ° C, 5% CO 2 культуре ткани инкубатора до готовности к экспериментам. Как правило, островки вручную и считается до экспериментаimentation. 3. Представитель Результаты Островок дает, морфологии и качества общих параметров, используемых для судить об успехе островок изоляции. В наших руках, островок доходы от средней C57BL / 6 мышей находятся в диапазоне 150-250 островков с помощью этого протокола (см. таблицу 2), и сопоставимы с данными, полученными оптимизированы Sigma типа XI коллагеназы. Тем не менее, выход может меняться в зависимости от используемого штамма мыши и возраст мыши. Большинство животных мы используем в 8-16 неделе возрастной диапазон Этот протокол был протестирован на нескольких линиях мышей, в том числе C57BL / 6 (180-250 островков / мышь), CD1 (200-300 островков / мышь), 129 / B6 (200-300 островков / мышь), BLKS-db/db (120-200 островков / мышь), NOD (10 недельных, 100-150 островков / мышь) и NOD-SCID (100-150 островков / мышь ). Типичная морфология островок показано на рисунке 2, в которой островки имеют круглую в продолговатой формы с относительно одинакового размера (хотя размер юнифуormity может варьироваться от штамма к штамму). Рисунок 3 показывает наш анализ типичных глюкозо-стимулированной секреции инсулина из C57BL / 6 мышей островки выделяли с использованием очищенной TDES против Sigma типа XI коллагеназы. Как правило, высокое качество подготовки островка приводит к стимуляции инсулином при 25 мМ глюкозы, которая 6-20 раз больше, чем наблюдалось в 2,5 мМ глюкозы. Другие приложения могут быть также использованы для проверки качества изолированные островки, и они включают использование perifusion методы, Ca 2 + томография (с Fura2) и обратной транскрипции ПЦР, в частности 11. Рисунок 1. Резюме катетеризации желчных протоков. Рисунок 2. Типичный вид C57BL / 6 островков в 24 часов следующих изоляции. Изображения были приобретены впреобразуется микроскопом при 40-кратном увеличении. Рисунок 3. Глюкоза-стимулированной секреции инсулина C57BL / 6 островков. Через 24 часов следующих изоляции, 100 островков инкубировали в 12-луночных блюдо в течение 1 часа при 37 ° C в Кребса-Рингера HEPES-буферного раствора, содержащего 2,5 мМ глюкозы. Островки затем были переведены в Кребса-Рингера HEPES на 2,5 мМ глюкозы для дополнительного часа, после чего супернатант собирали для инсулина измерения с использованием двух-сайте immunospecific иммуноферментного анализа (ИФА) (Кристалл Chem). То же островки были впоследствии переданы Кребса-Рингера HEPES-буферном растворе, содержащем 25 мМ глюкозы и инсулина в среду измеряли с помощью ИФА через 1 ч инкубации.

Discussion

В этом протоколе, мы описали нашу процедура катетеризации, коллагеназы перфузии и диссоциации мышиной поджелудочной железы, с целью выделения островков Лангерганса. Технически, наш метод, овладев, должны обеспечивать изоляцию поджелудочной железы в течение 4 мин эвтаназии животных, и на 1 час должно привести к изоляции островков от одного животного. Быстрота методика позволяет выделить из островков до 12 мышей в типичном участке, в результате чего изоляции до 3000 островков.

В отличие от других протоколов, которые используют сырую препаратов коллагеназы, наш протокол имеет использование очищенных протеаз, CI фермента коллагеназы MA и CI фермента протеазы BP. Изменения в последовательности TDE препараты, которые являются коммерчески доступными требует, чтобы каждая партия индивидуально протестирована и оптимизирована до общего использования. Это много-к-много изменчивость привело нас к рассмотрению использования пуриFied TDES от VitaCyte. Эти высокоочищенного TDES характеризуется несколькими методами, включая применение чувствительных флуоресценции меченых анализы подложки. Анализа флуоресценции CDA более чувствительны к различным молекулярным формам коллагеназы, которые имеют различные кинетики в унижающему достоинство родного коллагена. Историческая пептида анализы субстрата дают неполную оценку коллагеназы. Характеризуя коллагеназы несколькими методами обеспечивает большую активность фермента между партиями.

Исходя из нашего внутреннего тестирования с использованием различных препаратов коллагеназы в продаже, мы обнаружили, что очищенный фермент комбинации дал воспроизводимые многие-к-много результатов. Основными преимуществами использования высокой степени очистки и тщательно характеризуется TDES в этом приложении раз оптимальный состав ферментов определен, многие-к-много производительности согласованность гарантирована. Эта согласованность исключает трудоемкий процесс много квалификация обычно требуетсядля продуктов сырая или обогащенные коллагеназы. Очищенный TDES также включить дополнительные изменения состава для улучшения урожайности и качества островки оправился от различных штаммов мыши. Отчетный оптимальных составов ферментов для выделения островков из разных линий мышей можно более эффективно общались. Это, в свою очередь, приводит к более продуктивного использования ресурсов и повышение гибкости в экспериментальном дизайне.

Есть много важных шагов, которые могут повлиять на исход островок изоляции с помощью нашего протокола. Во-первых, это необходимость обеспечения эффективного инфляции поджелудочной железы во время перфузии ферментного препарата. Важно, чтобы начать инфляции с нежной силой на шприце, а также увеличить силу, как поджелудочная железа раздувается. Это полезно для перемещения кишечника и поджелудочной железы поднять во время инфляции, так что коллагеназы perfuses весь орган. Другим важным шагом является силой, с которой трясет труб AfteГ инкубации при 37 ° C (шаг 2,2). Мы обнаружили, что встряхивая поджелудочной железы трудно против крышку трубки вызывает фрагментацию островки, но без какой-либо механической диссоциации на этот шаг, островок урожаи могут резко упасть. Важно также, что на этапе диссоциации со шприцем (шаг 2,5), среднего уровня сила применяется во время перемещения вверх и вниз с поршнем, что обеспечивает адекватное диссоциации ткани, прежде чем этап фильтрации (2,6), где очень мало ткань должна быть сохранена на сетчатый фильтр чая. И, наконец, последний шаг, чтобы внимательно следить является стремление всего 20 мл Histopaque фракционированного островков. Хотя островков, как правило, на стыке Histopaque и HBSS, мы обнаружили, что мы теряем островков, когда мы пытаемся удалить только интерфейс, вместо этого, мы теперь полностью удалить 20 мл использованием большого диаметра 25 мл пипетки. Мы добавили фильтрацию через перевернутый 70 мкм фильтром (шаг 2,11), чтобы устранить необходимость вentrifuge островки несколько раз, чтобы смыть Histopaque.

Materials

Name of Reagent	Company		Catalogue #
10X HBSS	Life Technologies	14065
RPMI	Fisher Scientific	10-040
BSA	Sigma Aldrich	any
Histopaque 1077	Sigma Aldrich	10771
Histopaque 1119	Sigma Aldrich	11191
4-0 Suture 100 yd roll	McKesson	451521
14 g blunt end needle	Fisher Scientific	14-8216M
Vannas Superfine Sciss	Fisher Scientific	501778
Curved Spring Scissors	Fisher Scientific	14127
Curved Forceps (2)	Fisher Scientific	15914G
Curved forceps (for 90 °)	Fine Science Tools	11052-10
27G 1/2 inch needle	Fisher Scientific	305109
30G 1/2 inch needle	Fisher Scientific	305106
PE tubing	Becton Dickinson	427411
Collagenase MA	Vitacyte, LLC	001-2030
BP Protease	Vitacyte, LLC	003-1000
3 ml syringe	Fisher Scientific	309585
30 ml syringe	Fisher Scientific	309650
70 μm filter	Fisher Scientific	352350
10 cm2 Petri Dish	Fisher Scientific	351005
Plastic tea strainer	Any kitchen supply
			Table 1. Reagents and Equipment
			Sigma type XI (l010M8618) MA (100615) BP (110329) MA (081104) BP (100823) MA (091211) BP (101109) 216 (±74) 260 (±45) 157 (±37) 200 (±4)
			Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses