Gen-ifadesi Makinaları Fonksiyonel Tahliller için Küçük ölçekli Nükleer ayıklar

Summary

Sağlam, küçük ölçekli HeLa çekirdek ekstreler hazırlanması için bir protokol tarif edilmektedir. Bu protokol, örneğin ilaçların veya RNAi ile muamele hücreleri gibi hücrelerin küçük popülasyonları, kullanımını gerektiren deneyleri için önemlidir. Metodu gen ifadesi deneyleri ve hasta hücreleri dahil olmak üzere diğer hücre tipleri, geniş bir yelpazede uygulanabilir olması gerekir.

Abstract

Anlayış gen ekspresyonu ilerleme çok sayıda in vitro sistemleri kullanılarak yapılmıştır. Çoğu çalışmaları için, fonksiyonel deneyleri süspansiyon yetiştirilen hücrelerinin 10-50 ya da daha fazla litre toplu olarak hazırlanmıştır ekstreler kullanılarak gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu büyük ölçekli preparatlar vitro etkileri hızla test edilmesi için müsait değildir vivo hücresel tedavisi ya da koşullarında çok çeşitli sonucu. Bu, Journal Video madde, örnek olarak HeLa hücreleri kullanılarak, fonksiyonel küçük ölçekli nükleer ekstreler hazırlanması için bir yöntemi göstermektedir. Bu yöntem, yapışık mono tabakalar olarak yetiştirilir hücreleri gibi birkaç 150 üç olarak mm levha kullanılarak gerçekleştirilir. Küçük ölçekli özleri etkinliğini göstermek için, biz onlar birleştirilmiş RNA Polimeraz II transkripsiyon / yapıştırma reaksiyonlar için toplu nükleer özler gibi aktif olduğunu göstermektedir. Özü protokol programı göstermek için, yapıştırma HeLa hücre hazırlanan özler kaldırılacaktır olduğunu gösteriyors raptetme inhibitörü ilaç E7107 ile muamele edilmiştir. Küçük ölçekli protokolü hücresel özleri kullanılarak in vitro araştırılması edilebilir herhangi bir işlem veya hücre tipi için genel olarak uygulanabilir olmalıdır. Bunlar, örneğin, küçük hücre popülasyonlarının ilaçların kullanımını gerektirir, DNA zarar verici ajanlar, RNAi veya transfeksiyon gibi çeşitli ajanlar maruz sınırlı miktarda veya hücrelerde yalnızca mevcut hastanın hücreleri içerir. Buna ek olarak, taze yetiştirilen hücreler, az miktarda uygun ve / veya bazı uygulamalar için gereklidir.

Protocol

1. Nükleer Ekstraksiyon için Büyüyen HeLa Hücreleri DMEM ortamı ile üç 150 mm levha üzerine plakası HeLa hücreleri% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş. Hücrelerinin% 90 konfluent kadar% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör büyür. 3 gün ayrıldıktan sonra bir konfluent plaka ve hasattan 01:10 İpucu-hücreleri ayırır. Tip-Fazladan bir plaka üç plakaları ile yeterince hücreler (örneğin, hücreler% 90'ından daha az birleşik eğer) bulunmaması halinde yetiştirilebilir. 2. Nükleer Özü Çözümler hazırlayın ve soğutun Tablo 2'de belirtildiği gibi taze çözümler hazırlayın. 15 ml Falcon tüp içine Hipotonik Buffer tablet 10 ml. 1.5 ml Eppendorf tüpler içine alikotu yüksek tuz Tampon ve Düşük Tuz Tamponu, 1 ml 1 ml. Buz üzerinde tamponlar soğutun. (Bakınız kullanmak üzere, her bir tampon PMSF ve DTT, uygun hacimleri ekleme hemen önce <strong> Tablo 1). 3. Nükleer Ekstraksiyon için HeLa Hücreleri Hasat Hücrelerinden ortamı aspire ve levha oda sıcaklığında 1X PBS 13 ml ile bir kez hücreleri yıkanır. PBS yıkama aspire. Sonra birkaç saniye bekleyip, kalan aspire, yan plaka duruyordu, ilk Çekiş tarafından olduğu kadar, PBS mümkün olduğunca Tip-aspire. Bir hücre yükleyici kullanılarak, plakaların alt kenarına hücreleri sıyırmak ve ardından bir Eppendorf tüpüne hücreleri transfer. Kabarcıkları yapmaktan kaçının. Kazınarak hücrelerin 3 tabak, 1,5 ml Eppendorf tüpe uygun olmalıdır. Tip-O bir Eppendorf tüpüne kullanıldığı takdirde hücrelerinin hacmi tahmin etmek için daha kolaydır. Ölçek için yukarı, Falcon tüpleri kullanın. Pelet hücrelere xg 100, 5 dakika süre ile, bir mikrofüj içerisinde 4 ° C'de santrifüje. 4. Hipotonik Tampon yılında HeLa hücreleri şişer </p> Dikkatle hücre pelletini gelen PBS aspire ve tüp üzerinde tonlama bakarak Paketli Hücre Hacim (PCV) tahmin ediyoruz. HeLa hücrelerinin Üç konfluent plakaları PCV yaklaşık 500 ul verim. Hücre topağı için Hipotonik tampon PCV 2X ekleyin. Hücrelerin tekrar süspansiyon hafifçe sallayın. Hafifçe gerekirse, aşağı ve yukarı pipetleme tarafından hücreleri tekrar süspansiyon bir P1000 Pipetman kullanın. Pelet hücrelere xg 100, 5 dakika süre ile, bir mikrofüj içerisinde 4 ° C'de santrifüje. * Hücreleri bu kez şişmeye başlamış olacak ve hücre hacmi şu anda 750 ul-1000 ul hakkında olmalıdır. Dikkatle Hipotonik Tampon aspire ve 1.5 ml nihai hacme yeni Hipotonik Buffer ekleyin. Hücreleri tekrar süspansiyon. 10 dakika süreyle buz üzerinde inkübe tekrar süspanse şişmiş hücreleri. 5.. Bir Dounce Homojenizatör kullanma Hücreleri Lyse Dounce durulayın ve ardından buz üzerine chill Hipotonik Tampon kullanın. Hassas bir görev wip ile havaneli kurulayınızER (örn. Kimwipe). 1000 ul genişletilmiş mikropipet ucunu kullanarak Dounce geri kalan tamponu çıkarın. Dounce içine şişmiş hücreler aktarın. Yavaş yavaş kabarcıkları önlemek için dikkatli olmak, akyuvarlar için 5 kez Dounce sıkı havaneli, yukarı ve aşağı. Dounce hücrelerin bir alikotu 5 ul kullanılarak hücre parçalanması için Assay. Bir Eppendorf tüp içinde tablet yerleştirin ve Tripan Mavi eşit hacimde ekleyin. Slayt üzerindeki karışımı koyun ve bir ışık mikroskobu kullanılarak hücrelerin inceleyin. Eridi hücrelerin çekirdekleri mavi görünecektir. Yaklaşık% 90 parçalama idealdir. İpucu-hücreleri dounced gereken zamanlarda sayısı Dounce gerginliğini bağlı olarak değişecektir. Ilk kez bu protokolü taşırken, Dounce her inme sonrası adımı 5.3 yaparak Dounce için sayısını belirler. Aşırı Dounce yapmayın, aşırı douncing çekirdeklerinin yok edecektir. Bir ön-chille ile lizlendi hücreleri aktarmakd Eppendorf tüpüne ve 1500 x g'de 5 dakika boyunca 4 ° C de mikrofuj spin. Pelet çekirdeği içermektedir. Dikkatle çekirdek bozmadan yeni bir tüpe süpernatant aktarın. Süpernatant sitoplazma içerir. İpucu-sitoplazma toplu özler (toplu özleri etkin bir S100 hazırlamak için 1) için kullanılan aynı yüksek hızlı sıkma kullanarak olarak kullanılabilir veya başka bir S100 için işlenebilir. 6. Çekirdekler Tuz Özü Tüpün üzerinde derecelendirme bakarak Paketli Nükleer Hacim (PNV) tahmin ediyoruz. 500 ul'lik bir PCV tipik olarak 400 ul'lik bir PNV verir. Borusunun alt ucu, bir mikropipet ekleme ve yavaş hafifçe karıştırma çekirdek içine tampon squirting tarafından çekirdekler Düşük Tuz Tampon ½ X PNV ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı yapmayın. Yavaşça pelet tamamen devam etmeden önce Düşük Tuz Tampon yeniden süspanse emin olmak için tüp hafifçe vurun. <li> Add ½ X Yüksek Tuz Tampon ve hızlı bir şekilde ters tüp 1 kez karıştırın ve PNV. Sallamayın. 30 dakika süre ile 4 ° C'de dönerler. Onları parçalama önlemek için Yüksek Tuz Tampon bulunan çekirdekleri ile nazik Tip-olun. 18,000 x g'de 15 dakika boyunca bir mikrofüj içerisinde 4 ° C'de dönerler. Süpernatant yüksek tuz nükleer ekstraktı (HS-NE) 'dir. Hücrelerin üç tabak genellikle HS-NE 500-600 ul verim. 7. Nükleer Özü Konsantre ve Dialyze Soğutulmuş mini centricons (Amicon) ve 14000 x g bir mikrofuge'de 4 50 dakika ° C için spin içine HS-KD 500 ul aktarın. Mini-centricon (Amicon) haricindekileri ve yeni bir Eppendorf tüp yerleştirin. 4 2 dakika süreyle Spin ° C HS-NE kurtarmak için 1000 xg. HS-NE yaklaşık 115 ul kadar konsantre olacak. Bir P200 Pipetman kullanarak, mini diyaliz Slide-A-Lyzers içine HS-NE 45 ul alikotları aktarabilir ve 50 koyunSoğutulmuş Diyaliz Tampon 0 ml. Slide-A-Lyzer alt şamandıranın altında aynı hizada olduğundan emin olun. 4 ° C'de 1-2 saat için karıştırılmaya KD diyaliz sonra bulanık görünür. İpucu-Do Bu santrifüj ekstresinin aktivitesini azaltır olarak, diyaliz sonrasında gözlenen bulutlu çökelti kaldırmak için santrifüjlenmez. KD hemen veya bölünüp edilebilir. Örnek kısımları flaş sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C'de muhafaza edilmelidir KD depolanır ve aktivitesini kaybetmeden en az iki donma-çözülme döngüleri tabi olabilir. 8. Temsilcisi Sonuçlar Son zamanlarda, raptetme için RNAP II transkripsiyon akuplaj için in vitro sistemleri etkin 2-5 geliştirilmiştir. Bu sistemler, toplu olarak yetiştirilen HeLa hücrelerinde istihdam ve böylece hızla çoklu numuneler üzerinde spesifik hücresel tedavilerin etkilerini test etmek mümkün olmamakta. Dayanarak, bu bir ihtiyaçnd küçük ölçekli bir özü protokolünün genel yarar (Tartışma bakın), biz sağlam bir küçük ölçekli nükleer özü yöntemi kurdu. Dökme Nükleer ekstresi ile küçük ölçekli nükleer özü RNAP II transkripsiyon / raptetme reaksiyon karşılaştırarak temsili veriler Şekil 2 'de gösterilmiştir. CMV promot.örünü içerir ve standart bir raptetme substrat (Ftz 3, Şekil 2A) Analiz için kullanılan kodlayan bir DNA CMV-yapı,. Bu yapı toplu (şerit 1-3) ya da küçük ölçekli (şerit 4-6) özü inkübe edildiğinde, pre-mRNA doğmakta benzer düzeylerde 5 dakika zaman noktasında (Şekil 2, hat 1 ve 4 ile sentezlenmiştir ). Daha da transkripsiyon engellemek için α-amanitin arasında ilavesinden sonra, raptetme ara ürünler ve raptedilmektedir ekstrelerin her iki tür (Şekil 2, şerit 2, 3, 5, 6) da benzer kinetiği olan zaman içinde birikmiş. Bu temsilcisi sonuçlar gösteriyor ki darbe verimliliği liderliğindeki RNAP II transkripsiyon / yapıştırma sistemi dökme ve küçük ölçekli nükleer özler benzer. Küçük ölçekli özü yöntemin yararlılığını ortaya özü raptetme inhibitörü, E7107 veya negatif kontrol bileşiği pladienolide F 6,7 ve ardından birleştirilmiş RNAP II transkripsiyon / raptetme deneyi yapılmıştır ile muamele HeLa hücreleri hazırlandı. Şekil 3, Pladienolide F ve E7107 tedavi edilen hücreler (10 dk zaman noktalarında) hem de hazırlanan ekstreler içinde etkin bir şekilde meydana RNAP II tarafından transkripsiyonu gösterilmiştir. Buna karşılık, yapıştırma Pladienolide F-tedavi hücrelerinden hazırlanan ekstrenin normal oluştu ama (Şekil 3, 20-60 dakika sürede puan) E7107 ile tedavi edilen hücrelerde kaldırıldı. Bu veriler, küçük ölçekli hücrelerin özel bir tedavi için küçük ölçekli nükleer ekstreleri kullanarak kavramının kanıtı. jpg "/> Şekil 1.. Küçük ölçekli Özü Protokolü şematik. P1 Adım. Hücreler, mono tabakalar gibi yetiştirilen bir hücre yükleyici kullanılarak plakalardan hasat edilmiş ve hipotonik tampon ilave edilerek şişmiş edilir. P2 Adım. Hücreler bir Dounce homojenizatör kullanarak eridi ve pelet için çekirdekleri santrifüj edilir. P3 Adım. Çekirdekler sitoplazma ayrılmış ve tuz ekstraksiyonu geçirilir. P4 Adım. Nükleer ekstrakt konsantre edilir ve diyaliz edildi. P5 Adım. Sonuçları nükleer ekstreleri (daha fazla ayrıntı için bakınız Şekil 2) işlevsel olduğunu olduğunu göstermektedir elde edilir. Şekil 2. Küçük ölçekli nükleer özleri eşleşmiş RNAP II transkripsiyon / yapıştırma tayininde sağlamdır. A. Coupled RNAP II transkripsiyon / yapıştırma için kullanılan CMV Ftz DNA örneğinin şematik. CMV promoter ve ekzondan ve intron boyutları gösterilir. Coupled RNAP B. KarşılaştırılmasıToplu nükleer özü veya küçük ölçekli nükleer özü kullanılarak II transkripsiyon / yapıştırma testi. Transkripsiyon ve raptetme 5 dakika 30 ve 60 dakika süre ile meydana gelmesine izin sonra α-amanitin ilave edildi. RNA, bir fraksiyonlara ekstre edilmiş ve% 5 denatüre poliakrilamid jel üzerinde ve phosphoimager ile tespit edildi. Raptetme ara ürünler ve gösterilir. Endojen U6 snRNA ve tRNA özü mevcut ve 32 inkübasyon sırasında P-etiketli belirtilmiştir olduğunu. Kuplajlı RNAP II transkripsiyon / yapıştırma sistemi üzerinde ayrıntılı bir protokol için 3 bakın. Şekil 3. Kırpılma inhibitörü ilaç E7107 ile tedavi HeLa hücrelerinden hazırlanan küçük ölçekli nükleer özleri ekleme de bozuk. Hücreler 3 mM Pladienolide ile tedavi edildi F veya E7107 gibi6 açıklanan ve daha sonra küçük ölçekli nükleer ekstreler hazırlamak için kullanılmıştır. Bir kez tabii Şekil 2 'de anlatılanla aynı transkripsiyon / raptetme deneyi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Raptetme ara maddeler ve ürün, ve U6 snRNA ve tRNA gösterilir.

Discussion

Biz monotabaka olarak yetiştirilen HeLa hücrelerinde az miktarda nükleer özler hazırlanması için hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntem kurduk. Biz bu özler RNAP II transkripsiyon / yapıştırma tahlillerin kinetik ve verimliliği, küçük ölçekli ve toplu nükleer özler benzer olduğunu göstererek sağlam olduğunu gösterdi. Biz kırpılma inhibitörü ilaç ile tedavi hücrelerinden hazırlanan özler transkripsiyon ama yapıştırma kusurlu için aktif olduklarını göstererek özlerinin yardımcı gösterdi.

Küçük ölçekli nükleer ekstreler hazırlanması için yöntem, daha önce büyük ölçekli ^1,8 içinde süspansiyon yetiştirilen HeLa hücreleri ekstreler ve ekstre ⁹ küçük ölçekli hazırlanması için bir yöntem yapmak için yöntemler kurulan birleştirerek ve optimize etmek kurulmuştur. Önceki küçük ölçekli özleri gibi birleştiğinde transkripsiyon / sp, bazı testler için işlevsel değildi, çünkü bizim protokol kurulantahlil licing. Önceki küçük ölçekli protokolü ⁹ ile bizimki arasında önemli bir fark, önceki protokolü bir küçük iğne ile ⁹ aktararak hücreleri parçalanır, oysa biz bir mini-Dounce kullanarak hücrelerini parçalayan koşulları optimize olmasıdır. Ekstreleri, bazı testler için yeniden etkin ve / veya zordu neden açıklayabilir kabarcıklar iğne parçalama sonuçları. Biz de protokole bir konsantrasyon adımı ekledi. Bu adım konsantrasyonu son derece duyarlı olan özler, aktivitesini artırır ve aynı zamanda küçük ölçekli hazırlıklarına doğasında vardır özleri arasında değişkenlik sınırlar. Son olarak, rutin olarak hazırlanması dökme ekstreler göre aktivitesi üzerinde anlamlı bir etkisi olmayan, tek tabaka hücrelerin sadece üç 150 mm levha ile gerçekleştirilir. Böylece, işlem masraflı reaktifler veya sınırlı hücre durumu gerektiren küçük ölçekli hazırlıkları için hazır tâbidir. Örneğin, biz sma hazırladıkll ölçekli RNAi Knockdown hücrelerinden ve Kronik Lenfositik Lösemi (KLL) hasta hücreleri alıntılar ve fonksiyonel ve / veya biyokimyasal testler (EGF, JLH, TY ve RR, yayınlanmamış) için bu özleri kullanılmaktadır. Biz RNAi gibi immunopreciptations, Batılıların ve gümüş boyama gibi özel biyokimyasal testler, takip için özler değerli olduğunu bulduk. Belirli bir protein vurma etkinliği kurduktan sonra, daha ayrıntılı bir çalışma düşük maliyetle ilave ekstreler hazırlamak için kullanılabilen bir stabil demonte hücre hattı, yaparak gerçekleştirilebilir. Proteinlerin kütle spektrometrisi, aynı zamanda yöntemin yararlı bir uygulama olacak bu demonte hücre hatları elde immunoprecipitates içinde mevcut. Buradaki protokol açıklama için bir örnek olarak kullanılmaktadır ki çiftli transkripsiyon / assay raptetme ek olarak, küçük ölçekli ekstreler gibi farklı st için kullanılanlar gibi, çok sayıda işlevsel ve biyokimyasal deneyleri için genel olarak uygulanabilir olmalıdırgen ekspresyonu eps (kapatma, yapıştırma, transkripsiyon, poliadenilasyon, mikroRNA işleme gibi). Protokol ayrıca iki süspansiyon elde (örneğin KLL hücreleri gibi) ya da (örneğin hastanın fibroblast gibi) kültür yetiştirilebilir hasta hücre türleri için adapte edilebilir. Son olarak, işlem sırasında elde edilen sitoplazmik fraksiyonu sitoplazma gerektiren işlevsel ve biyokimyasal hem deneyleri için yararlı olmalıdır.

Materials

Name of the reagent	Full name of reagent	Company	Catalogue number
HEPES	4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid	Sigma	H3375-500G
MgCl2.6H2O	Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma	M2670-500G
KCl	Potassium Chloride	Fisher	P335-212
PMSF	Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma	P7626-100G
DTT	Dithiothreitol	American Bioanalytical	AB00490-5G
EDTA	Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate	American Bioanalytical	AB00500-01000
Glycerol		MP Biomedicals	800689
DMEM	Dulbecco’s Minimal Essential Medium	Invitrogen	11995-073
FBS	Fetal Bovine Serum	Gibco	16140
Penicillin/Streptomycin		Gibco	15070
PBS	Phosphate Buffered Saline	Cellgro	21-040-CV
Trypan Blue Stain 0.4%		Gibco	15250
Cell Lifters		Corning	29442-200
150mm Plates		VWR	353025
Extended Micropipette Tip		Denville	P1126
Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle		Wheaton	357538
Slidealyzers, MWCO 10kDa		ThermoScientific	69572
Mini-Centricons, MWCO 3kDa		Millipore (Amicon)	UFC500396

Table 1. Specific Reagents and Equipment.

Solution	Final	Stock	Dispense
Hypotonic	10 mM HEPES, pH 7.9	1M HEPES, pH 7.9	5 ml
	1.5 mM MgCl2	1M MgCl2	750 μl
	10 mM KCl	3M KCl	1.67 ml
	0.2 mM PMSF	200 mM PMSF	500 μl
	0.5 mM DTT	2M DTT	125 μl
			Bring up to 500 ml with water
Low Salt	20 mM HEPES, pH 7.9	1M HEPES, pH 7.9	2 ml
	1.5 mM MgCl2	1M MgCl2	150 μl
	20 mM KCl	3M KCl	667 μl
	0.2 mM EDTA	0.5M EDTA	40 μl
	25% Glycerol	Glycerol	25 ml
	0.2 mM PMSF	200 mM PMSF	100 μl
	0.5 mM DTT	2M DTT	25 μl
			Bring up to 100 ml with water
High Salt	20 mM HEPES, pH 7.9	1M HEPES, pH 7.9	2 ml
	1.5 mM MgCl2	1M MgCl2	150 μl
	1.4M KCl	3M KCl	48 ml
	0.2 mM EDTA	0.5M EDTA	40 μl
	25% Glycerol	Glycerol	25 ml
	0.2 mM PMSF	200 mM PMSF	100 μl
	0.5 mM DTT	2M DTT	25 μl
			Bring up to 100 ml with water
Dialysis	20 mM HEPES, pH 7.9	1M HEPES, pH 7.9	10 ml
	100 mM KCl	3M KCl	16.625 ml
	0.2 mM EDTA	0.5M EDTA	200 μl
	20% Glycerol	Glycerol	100 ml
	0.2 mM PMSF	200 mM PMSF	500 μl
	0.5 mM DTT	2M DTT	125 μl
			Bring up to 500 ml with water

Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation.