שחול קבוע לחץ שבשליטת שיטה להכנת בגודל ננו שלפוחית שומנים
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה שחול להכנת שלפוחית השומנים של מיקרון משנה גדלים עם רמה גבוהה של הומוגניות. שיטה זו משתמשת במערכת לחץ מבוקר עם מבוקרים זרימת שיעורי חנקן להכנת liposome. הכנה שומנים בדם<sup> 1,2</sup>, שיחול liposome, ואפיון גודל יוצגו להלן.
Abstract
ליפוזומים הם בועיות שהוכנו באופן מלאכותי המורכב פוספוליפידים טבעיים וסינתטיים הנמצאים בשימוש נרחב כמו קרום התא מחקה פלטפורמת ללמוד חלבונים חלבונים חלבונים שומנים בדם אינטראקציות 3, משלוח צג התרופה 4,5, ו 4 אנקפסולציה. פוספוליפידים באופן טבעי ליצור bilayers השומנים מעוקלים, להבדיל את עצמו מן micelle. 6 ליפוזומים מסווגים באופן מסורתי על ידי גודל ומספר bilayers, כלומר שלפוחית unilamellar גדולות ('לאב'), שלפוחית unilamellar קטנים (רכבי השטח) ואת שלפוחית multilamellar (MLVs) 7. בפרט, הכנת ליפוזומים הומוגניות בגדלים שונים, חשוב ללמוד עקמומיות קרום זה ממלא תפקיד חיוני איתות התא, אנדו ו-exocytosis, איחוי קרום, וסחר חלבון 8. מספר קבוצות לנתח כיצד חלבונים משמשים לווסת את התהליכים הכרוכים עקמומיות הממברנה ובכך להכין ליפוזומים בקטרים של פחות מ -100 – 400ננומטר ללמוד את ההתנהגות שלהם על פונקציות התא 3. אחרים מתמקדים אנקפסולציה liposome תרופות, לומד ליפוזומים כלי רכב לבצע ולספק סמים עניין 9. אנקפסולציה התרופה ניתן להשיג כפי שדווח במהלך היווצרות liposome 9. צעד שחול שלנו לא אמור להשפיע על התרופה Encapsulated משתי סיבות, כלומר (1) אנקפסולציה התרופה צריכה להיות מושגת לפני השלב הזה (2) ליפוזומים צריך לשמור על יציבות biophysical הטבעי שלהם, באופן מאובטח נושאת את התרופה הליבה מימית. מטרות אלה מחקר נוסף מצביעים על הצורך שיטת אופטימיזציה לעצב יציבים מיקרון משנה שלפוחית השומנים.
עם זאת, הטכנולוגיות הנוכחיות הכנה liposome (sonication 10, הקפאת-and-ההפשרה 10, שקיעה) לא מאפשרים הכנה של ליפוזומים עם משטח עקום מאוד (כלומר <בקוטר 100 ננומטר) עם עקביות יעילות גבוהה 10,5, אשר מגביל את biophysical מחקרים של emergiבתחום ng של חישה עקמומיות קרום. כאן, אנו מציגים שיטת הכנה חזק עבור מגוון רחב של ליפוזומים רלוונטיות מבחינה ביולוגית.
שחול ידני באמצעות גז חזק מזרקים וממברנות פוליקרבונט 10,5 היא מנהג נפוץ אך ההטרוגניות הוא נצפה לעיתים קרובות בעת השימוש גדלים הנקבוביות פחות מ -100 ננומטר בשל בשל השתנות של לחץ ידני מיושם. העסקנו מנגנון קבוע לחץ שבשליטת שחול להכין ליפוזומים סינתטיים אשר בקטרים לנוע בין 30 ל 400 ננומטר. פיזור אור דינאמי (DLS) 10, 11 ו במיקרוסקופ אלקטרונים Nanoparticle מעקב וניתוח (נ.ת. ע) 12 שימשו כדי לכמת את גודל liposome כמפורט בפרוטוקול שלנו, עם קלקר מסחרי (PS) חרוזים ששימשו כסטנדרט כיול. קשר ליניארי ליד נצפתה בין גודל הנקבוביות מועסק על ליפוזומים נקבע באופן ניסיוני, המעיד על איכות גבוהה של הכנה שלנו לחץ שבשליטת liposome נפגשוהוד. יתר על כן, הראינו כי שלפוחית שומנים שיטת הכנת חלה באופן כללי, ללא תלות בגודל liposome שונים. לבסוף, אנו הוכיחו גם במחקר כמובן אז אלה ליפוזומים מוכנים היו יציבים עד 16 שעות. פרוטוקול נציג בגודל ננו הכנה liposome באה לידי ביטוי בהמשך.
Protocol
Discussion
שימוש Liposofast Avestin LF-50 extruder, הראינו עד כמה קטן בגודל, ליפוזומים מלאכותיים מוכנים באמצעות מערכת לחץ מבוקר. חשוב לציין כי שלפוחית multilamellar ליצור באופן ספונטני לאחר הידרציה liposome, מה שעשוי להוביל לייצור של חלקיקים קטנים יותר. אלו שלפוחיות קטנות multilamellar בהכרח לזרום גודל גד?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הווארד יוז רפואי במכון (HHMI) בפרס חדשנות שיתופית. לאם נתמך על ידי איתות נייד תקנה המכון הלאומי לבריאות אימון מענק (T32 GM008759) ואת רות NIH ל Kirschstein קדם דוקטורט (CA165349-01). אנו רוצים להודות פרופ 'מיכאל Stowell (CU Boulder), פרופ' דאגלס ריס ופרופ 'רוב פיליפס (קלטק) להערות יסולא בפז שלהם.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 02432-25ML | 95% stabilizers |
| High Grade Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | |
| Liposofast LF-50 Extruder | Avestin, Inc. | ||
| Phospholipids | Avanti Polar Lipids | ||
| Polycarbonate Pores | Avestin, Inc. | 25 mm diameter | |
| Drain discs PE | Avestin, Inc. | 230600 | 25 mm diameter |
Riferimenti
- Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).
- Smith, S. A., Morrissey, J. H. Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes. J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).
- Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion. Cell. 138, 709-721 (2009).
- Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).
- Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. Extrusion technique to generate liposomes of defined size. Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).
- Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).
- Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O’Sullivan, C. K. Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes. J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).
- Zimmerberg, J., Kozlov, M. How proteins produce cellular membrane curvature. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).
- Chonn, A., Cullis, P. R. Recent advances in liposomal drug-delivery systems. Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).
- Matsuoka, K., Schekman, R. The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting. Methods. 20, 417-428 (2001).
- Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. , (2011).
- Hunter, D. G., Frisken, B. J. Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles. Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).
