Método de extrusão constante pressão controlada para a Preparação de vesículas lipídicas nanométricas

Summary

Este protocolo descreve um método de extrusão para a preparação de vesículas lipídicas de sub-micron tamanhos com um elevado grau de homogeneidade. Este método utiliza um sistema de pressão controlada, com taxas de azoto controlados de fluxo para a preparação de lipossomas. A preparação de lípidos^1,2, Extrusão de lipossomas, e caracterização do tamanho será aqui contidas.

Abstract

Os lipossomas são vesículas preparadas artificialmente constituídos por fosfolípidos naturais e sintéticos que são amplamente utilizados como uma membrana celular imitando plataforma para estudar proteína-proteína e proteína-lípido interacções ^3, o monitor de entrega de drogas ^4,5, e de encapsulamento ^4. Fosfolípidos naturalmente criar bicamadas lipídicas curvos, distinguindo-se a partir de uma micela. ⁶ Os lipossomas são tradicionalmente classificados por tamanho e número de bicamadas, ou seja, grandes vesículas unilamelares (LUV), pequenas vesículas unilamelares (SUVs) e vesículas multilamelares (MLV) ^7. Em particular, a preparação de lipossomas homogéneos de vários tamanhos é importante para o estudo de curvatura da membrana que desempenha um papel vital na sinalização celular, endo e exocitose, a fusão da membrana, e tráfico proteína ^8. Vários grupos analisar como as proteínas são usadas para modular processos que envolvem a curvatura da membrana e, assim, preparar lipossomas de diâmetros <100 – 400nm para estudar seu comportamento em funções celulares ^3. Outros concentram-se em lipossoma-droga de encapsulação, estudando os lipossomas como veículos para transportar e distribuir uma droga de interesse ^9. Encapsulação do fármaco pode ser conseguida como relatado durante a formação do lipossoma ^9. O nosso passo de extrusão não deve afectar o fármaco encapsulado por duas razões, ou seja, o encapsulamento da droga (1) deve ser alcançado antes de este passo e (2) lipossomas devem manter a sua estabilidade natural biofísica, de forma segura realização da droga no núcleo aquoso. Estes objetivos da pesquisa sugerem ainda a necessidade de um método otimizado para projetar estáveis ​​vesículas mícron sub-lipídicos.

No entanto, as actuais tecnologias de preparação de lipossomas (sonicação ^10, congelamento-descongelamento ^e-10, sedimentação) não permitem a preparação de lipossomas com a superfície altamente curvo (isto é, <diâmetro de 100 nm) com elevada consistência e eficácia ^10,5, o que limita a biofísica estudos de um EMERGIcampo ng de detecção de curvatura da membrana. Aqui, nós apresentamos um método de preparação sólida para uma variedade de lipossomas biologicamente relevantes.

Extrusão manual, utilizando gás-apertados seringas e membranas de policarbonato ^10,5 é uma prática comum, mas heterogeneidade é frequentemente observado quando se utiliza tamanhos de poro inferior a 100 nm devido à devido à variabilidade de pressão manual aplicada. Foram utilizados um aparelho de extrusão de pressão constante controlada para preparar lipossomas sintéticos cujos diâmetros variam entre 30 e 400 nm. Dispersão dinâmica de luz (DLS) ^{10, 11} e microscopia de electrões análise de nanopartículas de seguimento (NTA) ¹² foram utilizados para quantificar os tamanhos de lipossomas, tal como descrito no nosso protocolo, com poliestireno comercial (PS) pérolas utilizadas como um padrão de calibração. Uma correlação linear perto foi observada entre os tamanhos dos poros e trabalhadores dos lipossomas determinados experimentalmente, indicando alta fidelidade da nossa preparação pressão controlada lipossoma conhecihod. Além disso, mostrámos que este método de preparação de vesículas de lípidos é geralmente aplicável, independente de vários tamanhos de lipossomas. Por fim, também têm demonstrado em um estudo curso de tempo que estes lipossomas preparados foram estáveis ​​durante até 16 horas. Um representante de tamanho nano protocolo de preparação de lipossomas é demonstrado abaixo.

Protocol

1. Preparação de lipossomas Recuperar a 20 mL frasco de vidro com tampa de teflon. Limpar todo o material de vidro e seringas com clorofórmio antes de usar para evitar a contaminação. Transferir 100 uL de clorofórmio grau de reagente para o frasco de vidro usando uma seringa de vidro de 250 uL estanque ao ar. Adicionar 30 ul de metanol de grau reagente para o frasco de vidro mesmo usando uma seringa de vidro de 100 uL estanque ao ar. Para preparar um 2 mM 7:1.5:1….

Discussion

Usando o Avestin Liposofast Extrusor LF-50, foi demonstrado como pequeno porte, lipossomas sintéticos são preparados através de um sistema de pressão controlada. É importante notar que as vesículas multilamelares formam-se espontaneamente após a hidratação de lipossomas, que pode levar à produção de nanopartículas menores. Estas pequenas vesículas multilamelares inevitavelmente fluir através do maior tamanho dos poros da membrana de policarbonato, causando heterogeneidade em soluções de vesículas unila…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Chloroform	Sigma-Aldrich	02432-25ML	95% stabilizers
High Grade Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L
Liposofast LF-50 Extruder	Avestin, Inc.
Phospholipids	Avanti Polar Lipids
Polycarbonate Pores	Avestin, Inc.		25 mm diameter
Drain discs PE	Avestin, Inc.	230600	25 mm diameter