Presión constante controlada por extrusión Método para la preparación de vesículas de lípidos de tamaño nano-

Summary

Este protocolo describe un método de extrusión para preparar vesículas lipídicas de tamaños sub-micra con un alto grado de homogeneidad. Este método utiliza un sistema de presión controlada con tasas controladas de nitrógeno de flujo para la preparación de liposomas. La preparación de lípidos^1,2, Extrusión de los liposomas, y caracterización tamaño se presenta en este documento.

Abstract

Los liposomas son vesículas preparadas artificialmente que consisten en fosfolípidos naturales y sintéticas que se utilizan ampliamente como una membrana celular imitando plataforma para estudiar proteína-proteína y lípidos interacciones ^proteína-3, la entrega del monitor fármaco ^4,5, y la encapsulación ^4. Los fosfolípidos naturalmente crear bicapas lipídicas curvadas, distinguiéndose de una micela. ⁶ Los liposomas son tradicionalmente clasificados por tamaño y número de bicapas, es decir, vesículas unilaminares grandes (LUVs), las pequeñas vesículas unilaminares (SUVs) y vesículas multilamelares (MLV) ^7. En particular, la preparación de liposomas homogéneos de diversos tamaños es importante para el estudio de curvatura membrana que juega un papel vital en la señalización celular, endo y exocitosis, la fusión de membranas, y el tráfico de proteínas ^8. Varios grupos de analizar cómo las proteínas se utilizan para modular los procesos que involucran a la curvatura de la membrana y por lo tanto preparar liposomas de diámetro <100 – 400nm a estudiar su comportamiento en ³ funciones celulares. Otros se centran en la encapsulación en liposomas de drogas, el estudio de los liposomas como vehículos para llevar y entregar un fármaco de interés ^9. Encapsulación de fármacos se puede lograr como se informó durante la formación del liposoma ^9. Nuestra etapa de extrusión no debe afectar el fármaco encapsulado por dos razones, es decir, (1) encapsulación del fármaco debe lograrse antes de esta etapa y (2) liposomas deben conservar su estabilidad biofísico natural, de forma segura la realización del fármaco en el núcleo acuoso. Estos objetivos de la investigación sugieren además la necesidad de un método optimizado para el diseño estables de sub-micrones vesículas lipídicas.

Sin embargo, las tecnologías actuales de preparación de liposomas ⁽¹⁰ sonicación, congelación-descongelación y la ^10, la sedimentación) no permiten la preparación de los liposomas con una superficie muy curvada (es decir, un diámetro <100 nm) con una alta consistencia y eficiencia ^10,5, lo que limita la biofísica estudios de un EMERGIcampo ng de detección de curvatura de la membrana. Aquí, presentamos un método de preparación sólida para una variedad de liposomas biológicamente relevantes.

Extrusión manual utilizando Jeringas de gas y las membranas de policarbonato ^10,5 es una práctica común pero heterogeneidad se observa a menudo cuando se utiliza tamaños de poro menores de 100 nm debido a debido a la variabilidad de la presión manual aplicada. Se empleó una constante presión controlada aparato de extrusión para preparar liposomas sintéticos cuyos diámetros varían entre 30 y 400 nm. Dispersión de luz dinámica (DLS) ^{10, 11} y microscopía electrónica de análisis de nanopartículas de seguimiento (NTA) ¹² fueron utilizados para cuantificar los tamaños de liposomas como se ha descrito en el protocolo, con poliestireno comercial (PS) las perlas se utilizan como un estándar de calibración. Se observó una correlación lineal cerca se observó entre los tamaños de poro y los trabajadores liposomas determinados experimentalmente, lo que indica una alta fidelidad de nuestra presión controlada preparación de liposomas se reunióHod. Además, hemos demostrado que este método de preparación de vesículas de lípidos es aplicable en general, independiente de los diversos tamaños de liposomas. Por último, también hemos demostrado en un estudio de evolución en el tiempo que estos liposomas preparados fueron estables durante hasta 16 horas. Un representante de tamaño nanométrico protocolo de preparación de liposomas se demuestra a continuación.

Protocol

1. Preparación de liposomas Recuperar un vial de 20 ml de vidrio con una tapa de teflon. Limpiar todo el material de vidrio y jeringas con cloroformo antes de su uso para evitar la contaminación. Transferir 100 l de cloroformo grado reactivo en el vial de vidrio utilizando un 250 l hermético jeringa de vidrio. Añadir 30 l de metanol de grado reactivo en el vial de vidrio utilizando un mismo 100 l hermético jeringa de vidrio. Para preparar un 2 mM 7:1.5:1.5 fosfatid…

Discussion

Usando el Avestin Liposofast LF-50 Extrusora, hemos demostrado cómo de pequeño tamaño, los liposomas sintéticos se preparan a través de un sistema controlado por presión. Es importante señalar que las vesículas multilamelares se forman espontáneamente después de la hidratación de liposomas, que puede conducir a la producción de pequeñas nanopartículas. Estas vesículas multilamelares pequeñas inevitablemente fluirá a través del mayor tamaño de poro de membrana de policarbonato, causando la heterogeneid…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Chloroform	Sigma-Aldrich	02432-25ML	95% stabilizers
High Grade Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L
Liposofast LF-50 Extruder	Avestin, Inc.
Phospholipids	Avanti Polar Lipids
Polycarbonate Pores	Avestin, Inc.		25 mm diameter
Drain discs PE	Avestin, Inc.	230600	25 mm diameter