本研究で報告された新たなプロトコルが組み合わせによるマウスの単一細胞の解像度で肺転移の選択的検出を可能に<em>のin-situ</em>肺血流との固定とX-Gal染色<em> lacZを</em>タグ付きの腫瘍細胞。
転移は、がんの種類やがん研究の結果として、主な焦点の大半の死亡の主な原因である。しかし、放射線イメージングおよびそれらの治療根絶の成功により、微小転移の検出が制限されたままです。
動物モデルでは、がん研究のための貴重なツールが1であることが証明されているが、微小転移のモニタリング/可視化は、潜在的に臨床試験2で残念な結果につながる前臨床試験で転移拡散の挑戦と不正確な評価のままです。その結果、最終的にダウンして正常組織における単一細胞レベルへの転移の再現性と信頼性の高い検出を可能にするための方法を洗練することに大きな関心がある。主な焦点は、したがって、マイクロコンピューター断層撮影(マイクロCT)、陽電子放射断層撮影(PET)、生物発光や蛍光イメージングのようなin vivoでの腫瘍細胞の検出を可能にする技術は、オンになっている<> 3,4(商標)。我々は現在、別の骨肉腫モデルにおける原発腫瘍の増殖や転移の in vivoモニタリングのために、これらの技術を最適化している。これらの技術のいくつかは、定量PCR 5、6、FACSまたは組織学的染色の異なるタイプのような古典的な方法の横に転移の ex vivo での解析に使用することができます。ベンチマークとして、我々は発色基質5 -ブロモ-4 -クロロ-3 -インドリル-β-Dを代謝する細菌酵素β-ガラクトシダーゼをコードするlacZ遺伝子と本研究では、腫瘍細胞の安定なトランスフェクションまたは形質導入を確立している不溶性の藍色染料7〜-ガラクトピラノシド(X-Gal)を、ここに示すように、単一細胞レベルにマウス組織を ex vivoでの腫瘍細胞の高感度かつ選択的な組織化学ブルー染色をダウンできます。これは、新規性を評価する研究で転移8の正確な検証を可能にする機器を集中的に低コストではないツールですticancer療法9-11。 X-gal染色の制限要因はよく血管化組織の血液関連赤い染色をEGに低いコントラストである。肺組織では、この問題はその場での肺血流、最近ベルジッヒら 12血液からそれらをクリアすると下にその場でこれを修正して埋め込 むことが麻酔下のマウスの肺を灌流することによって確立された手法によって解決することができます気管を通じてインフレ。この方法はまた、肺の崩壊を防ぎ、それによって組織学的分析のために組織の品質を向上させる機能的な肺胞の形態を維持しています。そこで、本研究では 、lacZ 発現腫瘍細胞と肺組織のin-situ灌流および固定のX-gal染色の組み合わせを活用して新しいプロトコルを記述します。この洗練されたプロトコルは、肺内の単一の転移細胞の高感度検出を可能にし、A〜Dの最近の研究で私たちを有効にもともと14非転移性であることが記載されたマウスモデル13に"休止状態"肺の微小転移をetect。
Dunn/LM8マウスOSモデルでここに示された結果は、肺組織のin-situ灌流/固定でのlacZ-タグ腫瘍細胞のX-gal染色を組み合わせて新たに確立された方法の力を発揮。 2つの技術のこの組み合わせは、単一細胞レベルに微小転移病変の高感度検出を停止でき、また、肺の表面( 図1)と同様の肺切片における( 図2)macrometastasesの可視化を向上させます。 X-gal染色も自然なので、血液と組織関連の色の他の臓器のin-situ灌流/固定で(マイクロ)転移の検出がわずかに肺以外の組織における転移巣の検出能を向上させることができますがこれらの器官13。灌流が別の臓器に向けられている場合であっても、肝臓を例えば 、血液の除去は部分的にしかコントラストベットを改善するであろう〜だと思うX-gal染色や臓器の自然な色。しかし、この方法はlacZをタグ付きの腫瘍細胞の任意のタイプに適用され、飛躍的に休眠中の単一セルの微小転移のレベルに肺転移の検出能を向上させ、ダウンマクロおよび微小転移の簡単で信頼性の高い定量が可能になります。この方法の限界及びルシフェラーゼおよび蛍光タンパク質を含むレポーター遺伝子に基づいている他のすべての技術は、導入遺伝子の発現の安定性である。 図2dに示すように、macrometastatic病巣内の全ての腫瘍細胞は、β-ガラクトシダーゼ活性の不足を示す青色に染色されています。これは、壊死に関連するかもしれないが、それは可能性が高く、導入遺伝子発現の損失によるものである。私たちは、ダンとLM8細胞が発現させるためであっても連続的な選択の下lacZおよび他の導入遺伝子のダウンレギュレーションに非常に有効であることを観察した。そこで我々は、マウスK12に最近の研究で切り替えとK7M2と人間HOS、143BとSAOS-2骨肉腫細胞株、in vitroでのすべての維持安定lacZ発現ならびに生体内では、最大時間をかけて100%に。
lacZの発現が保証されて安定したら、この技術は、機構的に転移性病変の根絶15を目指して新たな治療法の開発およびテストを行うためだけでなく、組織の植民地化13のプロセスを調査するために例えば、遺伝子操作された腫瘍細胞を用いた研究で適用することができます、16。さらに、転移性病変の早期検出のために使用される、例えば、PET、(マイクロ)、CTやMRIなどの現在の放射線イメージング技術、改善のためのベンチマークとして機能することができます。異なるトレーサーとの最近のPET研究(未発表)では、我々 は 、in vivoで検出された肺で記述されたプロトコルで、その後、ex vivoで転移が確認された。新しい小動物マイクロCTとの継続的な研究では(SkyScan)我々はこれまでにABですleは0.5ミリメートルとex vivoでダウンして0.3 mmまでのサイズにインビボで肺転移をダウン検出するが、我々は0.1ミリメートルの分解能を目指しています。興味深いことに、これは我々がマクロからのin-situ灌流およびX-gal染色を組み合わせた方法で微小転移を区別するために設定されたサイズ制限があります。これは、再びこの簡単かつ費用対効果の高い技術の感度と有用性を強調している。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、肺血流のテクニックで彼の忠告博士Luborベルジッヒ(生理学研究所、チューリッヒ大学)に感謝したいと思います。この作品は、カントンチューリッヒのKrebsliga、ウォルターL.とヨハンナウルフ財団、チューリッヒ、リディアHochstrasser財団、チューリッヒ、スイス国立科学財団、SNF、スイス、Schweizerischer法令に基づく連合組織体Balgrist、大学からの補助金によって支えられてチューリッヒの。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Narketan10 (ketamine) | Vétoquinol AG | 100 mg/ml solution | |
Xylazin (xylazine) | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml solution | |
Prequilan (acepromazine) | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml solution | |
Bulldog Type Serrefine vascular clamp | Fine Science Tools | 18051-35 | curved, 35 mm |
Plastic cup with lid | Semadeni | 2988 | 25 ml cups with lids |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder | Axxora | ALX-582-002-G005 | dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C |
Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month | self-made | 100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate | |
PolyFreeze Embedding Medium | Polysciences; swiss distributor: Brunschwig | 19636-1 | |
Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
Leica CM1850 cryostat | Leica Microsystems | ||
SuperFrost slides | Menzel | J1800AMNZ | |
Nuclear-Fast Red – Aluminum sulfate solution | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite | 84-0241-00 | |
Immu-Mount | Thermo Electron, swiss distributor: Histocom | 9990412 |
Table 1. Reagents and Equipment.