Улучшена визуализация метастазов в легких на одной резолюции сотовый у мышей, комбинированные<em> В месте</em> Перфузии легочной ткани и X-Gal Окрашивание<em> LacZ</em>-Меткой опухолевых клеток

Summary

Роман протокол сообщили в настоящем исследовании, позволяет избирательно обнаружения метастазов в легких в одной резолюции клетки у мышей, комбинированные<em> На месте</em> Перфузии легкого и фиксации и X-Gal окрашивание<em> LacZ</em> С метками опухолевых клеток.

Abstract

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.

While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research¹, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials². Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging^3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR⁵, FACS⁶ or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme β-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye⁷ and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis⁸ in studies assessing new anticancer therapies^9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.¹² who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect “dormant” lung micrometastases in a mouse model¹³, which was originally described to be non-metastatic¹⁴.

Protocol

1. В месте перфузии легкого и фиксация Anesthetize мышей IP-инъекции ~ 150 мкл фосфатным буферным раствором (PBS), содержащего 112,5 мг / кг (масса тела) кетамин, 16,5 мг / кг ксилазина и 15 мг / кг Ацепромазин (или другой анестезии, содержащие соответствующие болеутоляющие средства). Когда рефлексы у мышей больше не наблюдается, зафиксировать его на операционный стол обратно вниз и влажный мех с 70% этанола, чтобы пятно волосы вниз. Откройте кожу от живота до шеи и потяните ее в сторону или удалить его. Откройте брюшины и грудной клетки с достаточным размером. Предотвращение разрывов крупных сосудов (например, jugularis пола), чтобы избежать снижения эффективности последующей перфузии. Вырезать полой вены caudalis под печенью. Используйте 20 мл шприц оснащен 21G – 24G иглу вводят медленно 10-15 мл PBS в правый желудочек бьющегося сердца, пока легкие полностью белый исердце перестает биться (асистолия). Повышение от кровеносных сосудов на печени и диафрагмы с сосудистым зажимом. Используйте в 10 мл шприц оснащен 21G – 24G иглу вводят ~ 2 мл 3% параформальдегидом (PFA) в PBS в правый желудочек. Раскройте трахею снаружи грудной клетки. Используйте тот же шприц для введения ~ 3 мл 3% PFA в PBS черепа (за пределами грудной клетки) в трахею до легкого завышены. Сразу же после удаления игл, отщипывать трахеи хвостового из прокола с сосудистым зажимом и ждать 10 минут, чтобы позволить фиксации. Разрез кровеносных сосудов выше сосудистый зажим, снимите зажим и вводят ~ 2 мл PBS в правый желудочек, чтобы удалить излишки PFA. Прокол нижней части всех долей легких с помощью иглы, удалить сосудистый зажим на трахею и вводить 3-5 мл раствора PolyFreeze вложения средне / PBS 1:01 в трахею хвостового первого прокола до PFA в легкоедолей заменяется решением. Снимите легких, осторожно потянув сердце с щипцами и пересекающих соединительной ткани связок, кровеносных сосудов и трахеи. Держите сердце связан с легкими. В зависимости от того, как приступить к анализу легочной ткани продолжить протоколы, описанные в разделах 2 и 3. Если вы хотите сделать и анализы, удалить одно легкое доли и действуйте, как описано в возрасте до 3. Процесс оставшихся долей подключен к сердцу, как описано в разделе 2. 2. Визуализация LacZ с метками метастатических опухолевых клеток в целых долей легких Поместите легких в пластиковой чашке с плотной крышкой закрытия и исправить ее с 2% формальдегида в PBS при комнатной температуре в течение 30-60 мин. Удалить фиксации решения и тщательно промойте 3 раза с PBS. Добавить по крайней мере, 10 мл свежеприготовленного 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозид (X-Gal) окрашивание раствора (X-Gal раствора [40 мг / мл вДиметилформамид] 1:40 разводят в Основной красящий раствор, рН 7,1 (табл. 1); защиты от света). Положите кусок марли в верхней части бассейна легкие, чтобы держать его полностью в растворе и положите крышку лишь в общих чертах на горшок, позволяющие осуществлять обмен воздуха. Инкубировать при 37 ° С в течение 3-5 часов в защищенном от света. Удалить X-Gal раствора, промойте один раз PBS для удаления остаточных X-Gal решение (по желанию) и добавить 4% PFA. 3. Визуализация LacZ с метками метастатических опухолевых клеток в легких Cryosections Prefill помечены вложения форму на 1/3 неразбавленным среднего вложения PolyFreeze. Положить доля легкого сверху и залейте вложения среде до лопасть полностью покрыта. Постарайтесь предотвратить пузыри. Инкубируйте встроенных легких при 4 ° С в течение 20 мин. Тогда заморозить встроенных легких медленно в смеси сухого льда и изопентана и хранить при температуре -80 ° C. Вырезать 7-10 мкм криоразделах, посвященных криостата и смонтировать их на SuperFrostPlus слайды микроскопом. Инкубируйте разделов сразу с X-Gal окрашивание раствора при 37 ° С в течение 24 ч во влажной камере. Промыть слайдов в PBS 2 раза в течение 5 мин, а затем кратко в дистиллированной воде. Counter-пятно с ядерными быстрым красным в течение 10-30 секунд, промыть в дистиллированной воде и смонтировать слайды с иммуно-горе. 4. Представитель Результаты Асаи и соавт. Сообщили в оригинальной статье на Dunn-производные LM8 мышиной модели ОС, которая SC первичных опухолей, полученных от родительской клетки Данн, отличаются от тех, происходит от высокой метастатической LM8 к югу клеточной линии, не самопроизвольно образуют обнаружены метастазы в легких сингенных C3H мышей 14. С Здесь сообщил методы, мы переследованию образованию метастазов в Dunn/LM8 мышиных моделях ОС. Мы воспользовались стабильной LacZ-трансдуцированных Данн и LM8 клеткиы и протокол на месте перфузии легкого и фиксации у мышей. Представитель изображений перфузии и не перфузии легких мышей подкожно с LacZ-трансдуцированных и не трансдуцированных управления Данн и LM8 клетки показано на рисунке 1. В мышей, которым вводили контрольные клетки Данн, макроскопические и микроскопические метастазы остались обнаружить в не-перфузии и перфузии легких (рис. 1А, I-IV). Но, что интересно, в мышей, которым вводили Dunn-LacZ клеток, X-Gal окрашивание выявило синие микрометастазов очагов отдельных клеток или небольших скоплений клеток (<0,1 мм) на поверхность без перфузии легких (рис. 1А, VI). В месте перфузии и фиксации легких дальнейшее совершенствование выявляемости Dunn-LacZ микрометастазов (рис. 1А, VIII). Тем не менее, результат для макроскопических очагов не наблюдается (рис. 1А, V, VII). </ P> В мышей, которым вводили управления LM8 клетки, полупрозрачные, едва уловимым macrometastatic очагов более 0,1 мм в диаметре, были признаны в не-перфузии легких (рис. 1б, г). Перфузии легкого (рис. 1б, в) не улучшает обнаружение очагов. Тем не менее, в мышей, которым вводили LM8-LacZ клеток нескольких X-Gal окрашен в голубой цвет макро-(рис. 1Б, В) и микрометастазов (рис. 1б, VI) были обнаружены на поверхности, не перфузии органов. Кроме того, перфузии легких улучшена выявляемость макро-и микрометастазов (рис. 1б, VII – VIII). Следовательно, микро-и macrometastases стал видимым при более высокой плотностью и большим числом, в основном за счет полупрозрачности перфузии тканей, в которых очаги под поверхностью орган также стал видимым. Дополнительные чistological анализа с использованием cryosections легочной ткани подтвердили улучшенные возможности обнаружения метастазов в легких у мышей вводили LacZ-трансдуцированных Данн и LM8 клеток. У мышей с первичными опухолями, полученные из Dunn-LacZ или LM8-LacZ клеток, в отличие от мышей с первичными опухолями соответствующих контрольных клеток, микрометастазов или даже одной клетки очаги были признаны в легких секций (рис. 2). Кроме того, macrometastases также были более четко видны в мышей, которым вводили LM8-LacZ клеток, чем у животных, которым вводили управления LM8 клетки (рис. 2, D). Рисунок 1. Обнаружение спонтанных метастазов, не трансдуцированных (I-IV) и LacZ-трансдуцированных (V-VIII), Данн (А) и LM8 (B) клеток в не-перфузии (I, II, V, VI) и перфузии (III, IV, VII, VIII), легкие в C3H мышей. Метастазы в представительных X-Gal-станцииINED целом легких (V, VII в А и B) и соответствующие крупным планом (VI, VIII в А и B) голубого цвета. Macrometastatic очагов (> 0,1 мм) в органах мышей, которым вводили, не отмеченных LM8 клеток (I-IV в B), обозначены звездочками. Районы показано в крупных планов являются репрезентативными для всей легких. Масштаб полоски указывают на 1 мм в образах целом легких и 0,1 мм крупным планом. Нажмите, чтобы увеличить показатель . Рисунок 2. Обнаружение Данн и LM8 микрометастазов в легких cryosections. Разделы октября легочной ткани встроенный инкубировали в X-Gal красящий раствор при 37 ° С в течение 24 ч во влажной камере, а затем контрастно с ядерным быстрый красного цвета. Стрелки указывают на микрометастазов очагов признается в легких участков мышей, которым вводили Dunn-LacZ (B) или LM8-LacZ клеток (D). Micrometastases осталось обнаружить в легких участков мышей, которым вводили не-трансдуцированных Данн (A) или LM8 клеток (C). Масштаб полоски указывают на 0,1 мм.

Discussion

Здесь представлены результаты в Dunn/LM8 модель мыши OS продемонстрировать силу вновь созданный метод, который сочетает в себе X-Gal окрашивание LacZ с метками опухолевых клеток на месте перфузии / фиксации легочной ткани. Эта комбинация этих двух методов позволяет с высокой чувствительностью обнаружения микрометастазов поражения до одного уровня клеток, а также улучшает визуализацию macrometastases на поверхности легких (рис. 1), а также в легких секций (рис. 2). В то время как X-Gal окрашивание также позволяет обнаруживать (микро) метастазов в других органах, на месте перфузии / фиксации повышает выявляемость метастатических очагов в тканях, кроме легких незначительно из-за естественной крови и тканях связанных цвет этих органов ^13. Даже если перфузии направлено на другого органа, например печени, удаление кровь лишь частично улучшить контрастность ставкуWeen X-Gal окрашивание и естественный цвет органа. Тем не менее, метод применим к любому типу LacZ с метками опухолевых клеток, значительно улучшить выявляемость легких метастазы до уровня спящих одноклеточных микрометастазов и позволяет легко и надежно количественного макро-и микрометастазов. Ограничение этого метода и все другие методы, основанные на репортера генов, в том числе люциферазы и флуоресцентные белки, является стабильность экспрессии трансгенов. Как показано на рисунке 2-й, не все опухолевые клетки в macrometastatic очаги окрашен в голубой цвет, что указывает на отсутствие бета-галактозидазы. Это может быть связано с некрозом, но это, скорее всего, в связи с потерей экспрессии трансгенов. Мы заметили, что Данн и LM8 клетки очень эффективны в понижающей регуляции LacZ и другие трансгены даже при непрерывной селекции для самовыражения. Поэтому мы переключается в недавних исследованиях с мышиным K12и K7M2 и человеческого HOS, 143В и Saos-2 линии остеосаркомы клетки, которые все поддерживали устойчивые выражения LacZ в пробирке, а также в естественных условиях до 100% в течение долгого времени.

После стабилизации LacZ-выражения гарантируется, этот метод может быть применен в исследованиях генов манипулировать опухолевых клеток, например, для механистически исследовать процесс колонизации тканей ^13, а также для разработки и тестирования новых методов лечения, направленных на искоренение метастатических поражений ^{15 , 16.} Кроме того, она может служить в качестве ориентира для совершенствования текущих методов визуализации радиологических, таких как ПЭТ, (микро) КТ и МРТ, используемых для раннего выявления метастазов. В недавнем исследовании ПЭТ (неопубликованные) с различными индикаторов мы убедились в естественных условиях обнаружены метастазы в легких впоследствии бывший естественных условиях с описанным протоколом. В продолжающемся исследовании с новым мелких животных микро-CT (SkyScan) мы так далеко ABле для выявления метастазов в легких в естественных условиях до размера 0,5 мм и экс естественных условиях до 0,3 мм, но мы нацелены на разрешение 0,1 мм. Интересно, что это предельный размер, что мы устанавливаем отличить от макро-микрометастазов с комбинированным методом на месте перфузии и X-Gal окрашивание. Это вновь подчеркивает чувствительность и полезность этой простой и экономически эффективной техники.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Narketan10 (ketamine)	Vétoquinol AG		100 mg/ml solution
Xylazin (xylazine)	Streuli Pharma AG		20 mg/ml solution
Prequilan (acepromazine)	Fatro S.p.A.		10 mg/ml solution
Bulldog Type Serrefine vascular clamp	Fine Science Tools	18051-35	curved, 35 mm
Plastic cup with lid	Semadeni	2988	25 ml cups with lids
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder	Axxora	ALX-582-002-G005	dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C
Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month	self-made		100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate
PolyFreeze Embedding Medium	Polysciences; swiss distributor: Brunschwig	19636-1
Embedding mold	Polysciences	18646A-1
Leica CM1850 cryostat	Leica Microsystems
SuperFrost slides	Menzel	J1800AMNZ
Nuclear-Fast Red – Aluminum sulfate solution	Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite	84-0241-00
Immu-Mount	Thermo Electron, swiss distributor: Histocom	9990412

Table 1. Reagents and Equipment.