Den nya protokollet beskrivet i föreliggande studie tillåter selektiv detektering av lungmetastaser vid en enda cell upplösning i möss genom kombinerad<em> In-situ</em> Lunga perfusion och fixering och X-gal-färgning av<em> LacZ</em>-Märkt tumörceller.
Metastas är den främsta dödsorsaken i de flesta cancertyper och därmed en huvudsaklig inriktning inom cancerforskningen. Men att upptäcka mikrometastaser av radiologiska bildbehandling och framgång i deras terapeutiska utrotning förblir begränsad.
Medan djurmodeller har visat sig vara ett ovärderligt verktyg för cancerforskning 1 förblir övervakning / visualisering av mikrometastaser en utmaning och felaktig bedömning av metastatisk spridning i prekliniska studier potentiellt leder till dåliga resultat i kliniska prövningar 2. Följaktligen finns ett stort intresse för att förfina metoderna för att slutligen låta reproducerbar och tillförlitlig detektering av metastaser ner till en enda cell nivån i normal vävnad. Tyngdpunkten ligger därför på teknik som gör det möjligt att upptäcka tumörceller in vivo, som mikro-datortomografi (mikro-CT), positronemissionstomografi (PET), bioluminescens eller fluorescens avbildning <sup> 3,4. Vi är för närvarande att optimera dessa tekniker för in vivo övervakning av primär tumörtillväxt och metastas i olika osteosarkomceller modeller. Vissa av dessa tekniker kan också användas för ex vivo-analys av metastas bredvid klassiska metoder som qPCR 5, 6 FACS eller olika typer av histologisk färgning. Som ett riktmärke, har vi etablerat i föreliggande studie stabil transfektion eller transduktion av tumörceller med lacZ-genen som kodar det bakteriella enzymet β-galaktosidas som metaboliserar det kromogena substratet 5-brom-4-klor-3-indolyl-beta-D- -galaktopyranosid (X-Gal) till en olöslig indigo blått färgämne 7 och tillåter mycket känslig och selektiv histokemisk blå färgning av tumörceller i musvävnad ex vivo ned till en enda cell nivå som visas här. Detta är en låg kostnad och inte utrustning-intensiva verktyg som möjliggör exakt validering av metastaser 8 i studier bedömer nya enticancer terapier 9-11. En begränsande faktor X-gal-färgning är den låga kontrast till exempel blod-relaterade rödfärgning av väl vaskulariserade vävnader. I lungvävnad detta problem kan lösas genom in situ lunga perfusion, en teknik som nyligen inrättades av Borsig et al. 12 som perfunderades lungorna hos möss under anestesi för att rensa dem från blod och att fixa och bädda in dem på plats enligt inflationen genom luftstrupen. Denna metod förhindrar även kollapsen av lungan och därigenom bibehåller morfologin hos funktionella lunga alveoler, vilket förbättrar kvaliteten av vävnaden för histologisk analys. I föreliggande studie beskriver vi ett nytt protokoll, som tar fördel av en kombination av X-gal-färgning av lacZ-uttryckande tumörceller och in situ perfusion och fixering av lungvävnad. Denna raffinerade protokoll möjliggör högkänslig detektering av enstaka metastaserande celler i lungan och aktiverat oss i en färsk studie till detect "vilande" lung mikrometastaser i en musmodell 13, som ursprungligen beskrevs som icke-metastaserad 14.
De här presenterade resultaten i Dunn/LM8 mus OS modell visar kraften i det nybildade metod som kombinerar X-Gal färgning av lacZ-märkta tumörceller med in situ perfusion / fixering av lungvävnad. Denna kombination av de två teknikerna tillåter hög känslighet detektering av mikrometastatiska lesioner ned till enstaka cellnivå och även förbättrar visualisering av macrometastases på lungytan (figur 1) såväl som i lungsektioner (figur 2). Medan X-gal-färgning tillåter också detektering av (mikro) metastaser i andra organ, in situ perfusion / fixering förbättrar detekterbarheten av metastatiska härdar i andra vävnader än lungan endast något på grund av den naturliga blod-och vävnads-relaterad färg av dessa organ 13. Även om perfusionen riktas till ett annat organ, t.ex. lever, skulle avlägsnandet av blodet endast delvis förbättra kontrasten satsninglan X-Gal-färgning och den naturliga färgen på organet. Emellertid är metoden tillämpbar på varje typ av lacZ-märkta tumörceller, kommer att dramatiskt förbättra detekterbarheten av lungmetastas ned till nivån för vilande encelliga mikrometastaser och möjliggör en enkel och tillförlitlig kvantifiering av makro-och mikrometastaser. En begränsning av denna metod och alla andra tekniker som är baserade på reportergener, inklusive luciferas och fluorescerande proteiner, är stabiliteten hos transgen expression. Som visas i figur 2d, inte alla tumörceller inom macrometastatic fokus färgas blå, vilket indikerar en brist på beta-galaktosidasaktivitet. Detta kan vara relaterat till nekros, men det är mer sannolikt beror på en förlust av transgen expression. Vi observerade att Dunn och LM8 celler är mycket effektiva i nedreglering av lacZ och andra transgener även under kontinuerlig selektion för uttryck. Vi bytte därför nya studier till murina K12och K7M2 och de mänskliga HOS, 143B och Saos-2 osteosarkom cellinjer, som alla upprätthålls stabilt lacZ-uttryck in vitro såväl som in vivo upp till 100% över tiden.
När stabilt lacZ-uttryck garanteras, kan denna teknik användas i studier med gen-manipulerade tumörceller, t.ex. att mekanistiskt undersöka processen av vävnad kolonisering 13 samt för utveckling och testning av nya terapier som syftar till utrotning av metastaser 15 , 16. Dessutom kan det fungera som ett riktmärke för förbättringar av nuvarande radiologiska avbildningstekniker, såsom PET, (mikro) CT och MR, som används för tidig upptäckt av metastaser. I en nyligen PET-studie (opublicerad) med olika spårämnen vi verifierat in vivo detekterade lungmetastaser därefter ex vivo med den beskrivna protokollet. I en pågående studie med en ny liten djur mikro-CT (SkyScan) vi är så långt able att detektera lungmetastaser in vivo ned till en storlek av 0,5 mm och ex vivo ner till 0,3 mm, men vi strävar med en upplösning på 0,1 mm. Intressant nog är detta den storlek gräns som vi satt för att skilja makro-från mikrometastaser med den kombinerade metoden för in-situ perfusion och X-gal-färgning. Detta understryker återigen känslighet och nyttan av denna enkla och kostnadseffektiva teknik.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr Lubor Borsig (Institutet för fysiologi vid universitetet i Zürich) för hans råd om teknik lungan perfusion. Detta arbete har finansierats med bidrag från Krebsliga i Kanton Zürich, Walter L. och Johanna Wolf Foundation, Zürich, Lydia Hochstrasser Foundation, Zürich, Swiss National Science Foundation, SNF, Schweiz, Schweizerischer Verein Balgrist, och universitetet i Zürich.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Narketan10 (ketamine) | Vétoquinol AG | 100 mg/ml solution | |
Xylazin (xylazine) | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml solution | |
Prequilan (acepromazine) | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml solution | |
Bulldog Type Serrefine vascular clamp | Fine Science Tools | 18051-35 | curved, 35 mm |
Plastic cup with lid | Semadeni | 2988 | 25 ml cups with lids |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside (X-Gal); powder | Axxora | ALX-582-002-G005 | dissolve in N,N-Di-methylformamide to 40 mg/ml, store light-protected at -20 °C |
Basic staining solution, equilibrated to pH 7.1, stored light-protected at 4 °C for max. 1 month | self-made | 100 ml/L 10xPBS, 1.64 g/L K3Fe(CN)6, 2.1 g/L K4Fe(CN)6, 2 ml/L 1M MgCl2, 2 ml/L 10% NP40, 1 ml/L 10% Sodium-Deoxycholate | |
PolyFreeze Embedding Medium | Polysciences; swiss distributor: Brunschwig | 19636-1 | |
Embedding mold | Polysciences | 18646A-1 | |
Leica CM1850 cryostat | Leica Microsystems | ||
SuperFrost slides | Menzel | J1800AMNZ | |
Nuclear-Fast Red – Aluminum sulfate solution | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG distributor: Medite | 84-0241-00 | |
Immu-Mount | Thermo Electron, swiss distributor: Histocom | 9990412 |
Table 1. Reagents and Equipment.