Ingénierie bactéries adhérentes en créant un simple synthétique Curli Operon
Summary
La conception d'un encodage opéron synthétique à la fois l'appareil sécrétoire et les monomères de fibres structurelles curli est décrite. Surproduction de ces amyloïdes et les polymères adhérentes permet un gain mesurable de l'adhésion de l'<em> E. coli</em> Châssis<sup> 1</sup>. Une façon simple de visualiser et de quantifier l'adhérence sont expliqués.
Abstract
La méthode décrite ici consiste à redessiner E. coli propriétés d'adhérence par assemblage au nombre minimum de gènes curli sous le contrôle d'un promoteur fort et un métal overinducible, et à visualiser et de quantifier le gain résultant de l'adhésion bactérienne. Cette méthode s'applique principes d'ingénierie appropriées de l'abstraction et de la normalisation de la biologie synthétique, et les résultats de la BioBrick BBa_K540000 (Meilleur appareil BioBrick nouvelle, d'ingénierie, iGEM 2011).
La première étape consiste en la conception de l'opéron de synthèse consacré à la surproduction curli en réponse à métal, et donc à augmenter les capacités d'adhérence de la souche de type sauvage. L'original a été modifié curli opéron in silico afin d'optimiser signaux de transcription et de traduction et d'échapper à la régulation «naturelle» des curli. Cette approche a permis de tester avec succès notre compréhension actuelle de la production curli. Moreover, simplifier la réglementation curli en commutant le promoteur endogène complexe (plus de 10 régulateurs transcriptionnels identifié) à un simple métal réglementé promoteur rend l'adhésion beaucoup plus facile à contrôler.
La deuxième étape comprend l'évaluation qualitative et quantitative des capacités d'adhérence par la mise en œuvre de méthodes simples. Ces méthodes sont applicables à un large éventail de bactéries adhérentes indépendamment des structures biologiques impliqués dans la formation de biofilm. Test d'adhérence à des plaques de polystyrène de 24 puits fournit une visualisation rapide préliminaire du biofilm bactérien après coloration au cristal violet. Ce test qualitatif peut être aiguisé par la quantification du pourcentage d'adhérence. Une telle méthode est très simple mais plus précis que coloration au violet de cristal que comme décrit précédemment 1 avec une bonne répétabilité et de reproductibilité. Visualisation des bactéries GFP-marqués sur des lames de verre par fluorescence ou conf lasermicroscopie ocal permet de renforcer les résultats obtenus avec le test de la plaque de 24 puits par l'observation directe du phénomène.
Introduction
L'adhérence des bactéries à l'appui abiotiques jouent un rôle majeur dans les piles à combustible bioremédiation, biocatalyse ou microbienne. Procédés de bioremédiation utiliser les capacités des micro-organismes pour dégrader les substances organiques, ou de modifier la distribution des métaux (immobilisation, volatilisation) ou spéciation. Ces activités bénéfiques sont observés dans les écosystèmes aquatiques et terrestres, mais aussi dans les systèmes artificiels développés pour traiter l'eau polluée de déchets industriels et domestiques. L'intensité et de la qualité de l'activité microbienne dépend de facteurs physico-chimiques, mais aussi sur le mode de vie des micro-organismes (flottement libre ou encastré dans biofilm). La formation d'un biofilm est associée à une résistance à promouvoir le métabolisme des biocides par des mécanismes divers. Ce phénomène va donc être encouragée dans la plupart des processus de bioremédiation. En outre, les cellules d'Escherichia coli ingénierie pour contrôler la formation du biofilm a été appliquée avec succès àimmobiliser la cellule entière capteurs sur les biopuces 2-3.
Adaptation des micro-organismes à forte concentration de métaux se fait par des mécanismes divers tels que l'adsorption sur les composants de la matrice extracellulaire, l'activation de la pompe d'efflux ou supports spécifiques capables de concentrer le métal dans la cellule. Stimuler ces activités bactériennes par génie génétique permet un traitement efficace et pas cher de pollution par les métaux à l'échelle du laboratoire, en particulier dans le cas des métaux hautement toxiques en faible quantité, comme décrit par Raghu et al. 2008 4. Assainissement bactérienne représente dans ce cas une méthode économie compétitive et rentable par rapport aux procédés chimiques classiques utilisant des résines échangeuses d'ions. Les auteurs ont décrit un E. châssis coli génétiquement modifié pour l'absorption et la rétention de cobalt par KO première pompe d'efflux du gène codant RCNA, puis par transformation avec un plasmide multicopie surproduction permettant detransporteur avec captation préférentielle pour le cobalt. Une telle souche apparaît comme une alternative efficace aux résines échangeuses d'ions pour le traitement des effluents radioactifs, mais une question essentielle non résolue est la récupération de bactéries contaminés à la fin de la procédure 4. L'objectif de notre travail était donc de concevoir une souche conçu sur mesure pour coller sur des supports abiotiques tels que le verre ou le plastique.
Parmi l'ensemble des adhésines et des fimbriae adhérent identifiés dans bactéries Gram-, nous avons choisi de concevoir un système permettant la production de curli. Curli sont des fibres amyloïdes minces (2-5 nm de diamètre) et très agrégative qui font saillie à partir de la E. coli et Salmonella surface sous forme de matrice non cristalline insoluble et 5-7. Curli sont également impliqués dans la colonisation des surfaces abiotiques et le développement de biofilms 8. Curli ont été récemment montré à lier les ions de mercure 9. Amyloïdes sont en effet connus pour posséder une grandeaffinité pour les ions de métaux tels que le Cu 2 +, Zn 2 + et Fe 3 + 10. Cette propriété pourrait améliorer encore la décontamination des effluents pollués métalliques. Le cluster csg est responsable de la production de fibres curli et est constitué de deux opérons divergente transcrites (Figure 1). Le CSGB, csgA et les gènes SCSC constituent l'opéron sens, codant pour les deux sous-unités curli, l'ACPS et CSGB. SCSC semble être impliqué dans une activité redox dans le système de la biogenèse des curli et d'affecter le comportement des pores CsgG 11. Cependant, l'absence d'SCSC dans la majorité des bactéries productrices de curli indique que la protéine correspondante fournit seulement un niveau secundary de contrôle de la biogenèse des curli. Pour simplifier le système, nous avons choisi de travailler avec le nombre minimal de gènes.
Le csgDEFG operonencodes protéines essentielles dans la régulation et le transportde l'ACPS et CSGB à la surface cellulaire. CsgD est un activateur de la transcription de l'opéron csgBAC et joue un rôle clé dans le contrôle de la formation de biofilms en contrôlant la production de fimbriae curli et les composants du biofilm d'autres telles que la cellulose 12 et en inhibant la production flagelle 13. CSGE, CsgF et CsgG constituer un appareil de sécrétion curli spécifique dans la membrane externe à travers lequel la sous-unité protéique majeur curli ACPS est sécrétée comme une protéine soluble. La polymérisation de l'ACPS dépend in vivo sur la CSGB membranaire des protéines de nucléation (revue dans 14). Voies de régulation complexes impliquant plusieurs systèmes à deux composants ont été montré pour contrôler l'expression du gène curli 15-16. Ces règlements complexes permettent aux bactéries de former des biofilms épais via la production curli en réponse à des signaux environnementaux, mais sont difficiles à contrôler pour les applications industrielles. Afin de faciliter la reprise de l'a rencontréal-farcies bactéries au cours d'un processus industriel, la fixation des bactéries sur un support solide doit en effet être contrôlé par le paramètre bien défini (s). Les propriétés adhérentes de curli sont liés à leur 17 nature amyloïde et pourrait être utilisé pour améliorer les processus de bioremédiation, mais un dispositif simple et facile à contrôler doit être créé.
Parmi ces 7 gènes 18, un ensemble de 5 gènes absolument nécessaire pour la synthèse des curli (CSGB et des monomères de l'ACPS en fibre de codage) et à l'exportation (CSGE csgF et csgG, codant pour le complexe sécrétion curli) ont été sélectionnés pour construire l'opéron synthétique. Pour échapper à la régulation «naturelle» des curli, un opéron synthétique comprenant ces 5 gènes CSG sous le contrôle d'un promoteur fort et le cobalt-overinducible (figure 2) a été conçu et synthétisé. L'analyse pas-à-pas de la région codant pour curli et la procédure de conception pour un fonctionnement synthétique opéron sont décrits. Deux méthodes permettent de visualiser et de quantifier l'adhérence bactérienne au polystyrène et le verre sont expliqués.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes critiques
L'étape la plus critique dans cette approche de la biologie synthétique est la conception gène. Conception gène synthétique doit être méticuleux pour assurer une production efficace du système. Deux gènes codant pour les monomères de fibres et de trois gènes codant pour des protéines impliquées dans leur système de sécrétion ont été assemblés avec un promoteur fort et inductible métal pour créer une nouvelle unité fonctionnelle pour une nouvelle a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les autres membres de l'équipe iGEM INSA Lyon-ENS (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Ly Goki, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre-Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie et Valérie Desjardins Reverchon), nos commanditaires pour leur soutien financier (bioMérieux, Assystem, EDF, la Fondation INSA, ENS-Lyon et du Département des sciences biologiques de l'INSA de Lyon), F. Wisniewski-Dyé pour la lecture critique de ce manuscrit et le Dr Sze CC pour le cadeau de souche. Drogue B. reçoit un doctorat bourse de recherche de la Région Rhône-Alpes.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn–csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
Riferimenti
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. Microbial sensor cell arrays. Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).
- Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
- Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
- Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
- Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
- Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
- Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer’s A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
- Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
- Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
- Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. Biochimica. 50, 8281-8290 (2011).
- Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
- Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
- Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
- Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
- Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
- Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
- Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
- Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
- Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C., Callow,, J., Smith, A. M. . Biological Adhesives. , (2006).
- Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
- Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
- Miller, J. E. . Experiments in molecular genetics. , (1972).
