एक संशोधित EPA के 1623 विधि है स्पर्शरेखा फ्लो ultrafiltration खोखले फाइबर और हीट हदबंदी कदम का उपयोग जलजनित पता लगाने<em> Cryptosporidium</em> और<em> Giardia एसपीपी.</em
Summary
इस प्रोटोकॉल को जलजनित का पता लगाने के लिए वैकल्पिक कदम के रूप में एक स्पर्शरेखा प्रवाह खोखला फाइबर ultrafiltration नमूना एकाग्रता प्रणाली का उपयोग और एक गर्मी हदबंदी का वर्णन<em> Cryptosporidium</em> और<em> Giardia</emEPA के 1623 विधि का उपयोग प्रजातियों.
Abstract
Cryptosporidium and Giardia species are two of the most prevalent protozoa that cause waterborne diarrheal disease outbreaks worldwide. To better characterize the prevalence of these pathogens, EPA Method 1623 was developed and used to monitor levels of these organisms in US drinking water supplies 12. The method has three main parts; the first is the sample concentration in which at least 10 L of raw surface water is filtered. The organisms and trapped debris are then eluted from the filter and centrifuged to further concentrate the sample. The second part of the method uses an immunomagnetic separation procedure where the concentrated water sample is applied to immunomagnetic beads that specifically bind to the Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts allowing for specific removal of the parasites from the concentrated debris. These (oo)cysts are then detached from the magnetic beads by an acid dissociation procedure. The final part of the method is the immunofluorescence staining and enumeration where (oo)cysts are applied to a slide, stained, and enumerated by microscopy.
Method 1623 has four listed sample concentration systems to capture Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts in water: Envirochek filters (Pall Corporation, Ann Arbor, MI), Envirochek HV filters (Pall Corporation), Filta-Max filters (IDEXX, Westbrook, MA), or Continuous Flow Centrifugation (Haemonetics, Braintree, MA). However, Cryptosporidium and Giardia (oo)cyst recoveries have varied greatly depending on the source water matrix and filters used1,14. A new tangential flow hollow-fiber ultrafiltration (HFUF) system has recently been shown to be more efficient and more robust at recovering Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from various water matrices; moreover, it is less expensive than other capsule filter options and can concentrate multiple pathogens simultaneously1-3,5-8,10,11. In addition, previous studies by Hill and colleagues demonstrated that the HFUF significantly improved Cryptosporidium oocysts recoveries when directly compared with the Envirochek HV filters4. Additional modifications to the current methods have also been reported to improve method performance. Replacing the acid dissociation procedure with heat dissociation was shown to be more effective at separating Cryptosporidium from the magnetic beads in some matrices9,13 .
This protocol describes a modified Method 1623 that uses the new HFUF filtration system with the heat dissociation step. The use of HFUF with this modified Method is a less expensive alternative to current EPA Method 1623 filtration options and provides more flexibility by allowing the concentration of multiple organisms.
Protocol
1. स्पर्शरेखा फ्लो ultrafiltration खोखले फाइबर प्रक्रिया Buffers और समाधान की तैयारी: क्षालन समाधान (1 एल): अभिकर्मक ग्रेड पानी का 1 एल 0.1 ग्राम सोडियम polyphosphate, 0.1 मिलीग्राम बीच 80 और 0.01 मिलीग्राम वाई 30 antifoam जोड़ें. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में फिल्टर विधानसभा (चित्रा 1) तैयार: एक Masterflex / मैं पी पंप आसान लोड एक Masterflex / मैं पी परिशुद्धता brushless ड्राइव जुड़े सिर के माध्यम से Masterflex मैं / पी 73 प्रयोगशाला टयूबिंग डालें. सुरक्षित 0-60 साई, ग्लिसरीन भरा दबाव गेज एनपीटी टी संबंधक एक पेंच क्लैंप के साथ पंप सिर के ऊपर शाखा के साथ फिट करने के लिए टयूबिंग, और पंप सिर के एक HDPE टी संबंधक नीचे की ओर. 53 बी Masterflex एल / एस 15 प्रयोगशाला टयूबिंग के साथ टोपी Nalgene / भरने निकाल है और एक टी संबंधक फिटिंग और यह एक 1 एल Nalgene भारी शुल्क polypropylene के बोतल हासिल retentate बोतल को इकट्ठा करो. Masterflex एल / एस 24 टयूबिंग डब्ल्यू फिटith एक चुटकी (चुटकी 2 दबाना) दबाना और टी संबंधक एचडीपीई के यह retentate बोतल से कनेक्ट. दबाव नापने का यंत्र से Asahi Kasei Masterflex 24 एल / एस प्रयोगशाला टयूबिंग की एक पेंच क्लैंप के साथ कनेक्ट 25S उच्च प्रवाह अपोहक Rexeed की, और अपोहक से retentate बोतल. कस्टम दीन के ¼ "आईडी टयूबिंग को समायोजित करने के लिए ultrafilter खोखला फाइबर टयूबिंग कनेक्ट करने के लिए डिज़ाइन एडेप्टर का उपयोग करें. एक चुटकी दबाना (चुटकी 1 दबाना) के साथ फ़िट Masterflex 24 एल / एस प्रयोगशाला टयूबिंग और यह एक 10 मिलीलीटर की प्लास्टिक विंदुक टिप और कपास लिए नमूना तेज लाइन के रूप में कार्य करने के लिए हटा दिया प्लग के साथ कनेक्ट और फिर एचडीपीई देते टयूबिंग टी संबंधक. एक रैंप दबाना और प्रवाह फिल्टर के निकास अंत के पास स्थित बंदरगाह टयूबिंग कनेक्ट के साथ फ़िट Masterflex L/S-36 प्रयोगशाला टयूबिंग की एक छोर. दूसरे छोर को बर्बाद कंटेनर में रखें. 0.01 (w / v) 10 एल पानी का नमूना करने के लिए सोडियम polyphosphate% और 3 मिनट के लिए मिश्रण जोड़ें. चुटकी 2 दबाना बंदवेंट और retentate बोतल से और टोपी को हटा दें. अन्य सभी clamps के लिए खुला होना चाहिए. पंप दिशा सेट टी संबंधक से दबाव नापने का यंत्र (दाएं से बाएँ निम्नलिखित चित्र 1) के लिए तरल पदार्थ ले जाने के लिए. अधिकतम गति के 25% करने के लिए पंप की गति को समायोजित करें और पंप पर बारी. जब retentate बोतल 2/3 पूर्ण, खुले चुटकी 2 दबाना है और जल्दी से retentate बोतल वेंट टोपी की जगह. सभी लाइनें और फिटिंग करने के लिए सुनिश्चित करें वहाँ कोई लीक कर रहे हैं की जाँच करें. धीरे धीरे वांछित निस्पंदन दर (लगभग 1.5 एल / मिनट) के पंप की गति बढ़ाने के लिए, लीक के लिए जाँच. एक स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर और एक घड़ी या प्रवाह मीटर का प्रयोग, पानी प्रवाह लाइन (नीले एल / एस चित्रा 1 में 36 टयूबिंग) से बाहर निकलने की छानना दर की जाँच करें. हवाई बुलबुले आमतौर पर यह एक स्थिर दबाव और निस्पंदन दर प्राप्त करने के लिए मुश्किल बना फिल्टर के बाहर अंत में फार्म कर सकते हैं. यह हाथ से एक पल के लिए प्रवाह लाइन बन्द रखो सही है. इस कार्रवाईआम तौर पर छानना बंदरगाह हवा बुलबुला मनाना होगा और प्रवाह लाइन के माध्यम से बाहर निकलें. दोहराएँ के रूप में की जरूरत है, ध्यान में रखते हुए कि मटर आकार हवा बुलबुले अक्सर अपरिहार्य हैं. निस्पंदन प्रक्रिया मॉनिटर. मापने के लिए और दबाव और निस्पंदन दर के रूप में की जरूरत है रिकॉर्ड. दबाव में 20 साई कभी नहीं होनी चाहिए. यह सिफारिश की है कि निस्पंदन दर 2.0 एल / मिनट से अधिक नहीं होनी चाहिए. यह महत्वपूर्ण है कि retentate बोतल में पानी की मात्रा करने के लिए सुनिश्चित करें कि यह कभी नहीं खाली करने के लिए निगरानी की जानी है. यह मात्रा को बढ़ाने के लिए या थोड़ा कम करने के लिए सामान्य है. यदि retentate बोतल में पानी की मात्रा नीचे 1/3 पूर्ण गिरती है, तो वेंट टोपी को हटा दें और करीब चुटकी दबाना retentate बोतल लाइन पर 2. मात्रा के बारे में 2/3 के वापस लाओ, दबाना खुला और जल्दी से वेंट टोपी की जगह, एक तंग सील सुनिश्चित करने. यदि retentate बोतल में मात्रा जल्दी और लगातार गिरती है, तो यह सुनिश्चित retentate बोतल के ढक्कन तंग है और वेंट टोपी सुरक्षित जगह में है, और कि tubiएनजी पानी के नमूने के साथ संपर्क में अभी भी है. यदि इन मुद्दों को नहीं उत्पन्न कर रहे हैं, तो यह संभावना है कि retentate बोतल के ढक्कन में सील बुरा है और प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. जब नमूना कंटेनर खाली है, तो तुरंत करीब चुटकी 1 दबाना, इसकी अधिकतम के 20% करने के लिए पंप की गति को कम करने के लिए, retentate बोतल से वेंट टोपी के हटाने और रैंप दबाना बंद. लगभग 200 मिलीलीटर कस या ढीला रैंप दबाना retentate बोतल में नमूने की मात्रा समायोजित करें. के बाद मात्रा लगभग 200 मिलीलीटर है, क्षालन कदम (1.11-1.12) के लिए रैंप दबाना कस लें. नमूना कंटेनर क्षालन समाधान की 500 मिलीलीटर जोड़ें और कंटेनर के अंदर कुल्ला. 10 मिलीलीटर विंदुक कंटेनर कि क्षालन समाधान शामिल में नमूना तेज लाइन से जुड़ा रखें. सुनिश्चित करें कि रैंप दबाना बंद कर दिया है. ओपन चुटकी 1 दबाना और करीब चुटकी 2 क्षण भर दबाना क्षालन समाधान आकर्षित. क्षालन समाधान की 500 मिलीलीटर के बाद तैयार की गई है, बंद 1 क्लंप और खुले चुटकी दबाना 2 चुटकी. क्षालन समाधान अपनी अधिकतम के 20% के एक पंप की गति के साथ 5 मिनट के लिए प्रसारित करने की अनुमति. के बारे में 100 मिलीलीटर कस या ढीला प्रवाह लाइन पर रैंप दबाना द्वारा retentate बोतल में नमूने की मात्रा समायोजित करें. रैंप दबाना कस और नमूना 1 मिनट के लिए प्रसारित करने की अनुमति देते हैं. टयूबिंग में retentate बोतल में नमूने की मात्रा सुनिश्चित करने के द्वारा हवा खींच से बचें पर्याप्त उच्च करने के लिए एल / एस 15 retentate बोतल में प्रवेश टयूबिंग को कवर है. पंप जो retentate बोतल में नमूना बलों की दिशा रिवर्स. पंप रिवर्स में 20 ~ retentate बोतल में 225 मिलीलीटर की एक कुल में उत्पन्न सेकंड के लिए चलाने के लिए अनुमति देते हैं. बंद पंप मुड़ें. पंप सिर से Masterflex मैं / पी 73 टयूबिंग निकालें और दबाव नापने का यंत्र काट. Masterflex एल / एस 24 ultrafilter खोखला फाइबर बाहर निकलने टयूबिंग डिस्कनेक्ट. Retentate बोतल ऊपर टयूबिंग पकड़ में किसी भी शेष नमूना बलबोतल retentate. बोतल से सभी टयूबिंग डिस्कनेक्ट और एक गैर निकाल टोपी के साथ निकाल टोपी की जगह. ~ 225 मिलीलीटर retentate साथ आईएमएस / यूके प्रक्रिया को जारी रखें. 2. Immunomagnetic पृथक्करण की प्रक्रिया Buffers और समाधान की तैयारी: Cryptosporidium / Giardia कॉम्बो किट कमरे के तापमान तक पहुँचने के लिए: Dynabeads में शामिल बफ़र्स की अनुमति दें. 1X SL-बफर एक: 10X SL-बफर से 9 मिलीलीटर अभिकर्मक ग्रेड पानी की 1 मिलीग्राम जोड़ें. Retentate बोतल से एक लेबल 250 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब स्थानांतरण ~ तरल के 225 मिलीलीटर. दो बार retentate बोतल, अभिकर्मक पानी की 10 मिलीलीटर के साथ, कुल्ला और शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब rinses जोड़ें. 15 मिनट 4 ° सी कोई ब्रेक के साथ के लिए 1500 XG पर निलंबन अपकेंद्रित्र. ध्यान से गोली मात्रा के हर 0.5 मिलीलीटर (यानी महाप्राण (व्यंजन) 1 करने के लिए के लिए पैक गोली ऊपर 5 मिलीलीटर इंटरफ़ेस हवा – पानी से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन)1.3 मिलीलीटर की एक गोली मात्रा के ऊपर 5 मिलीग्राम, और 0.5 या उससे कम मिलीलीटर) की एक गोली के लिए 5 मिलीग्राम के लिए महाप्राण (व्यंजन). सतह पर तैरनेवाला में अच्छी तरह से vortexing और / या विंदुक मिश्रण द्वारा गोली resuspend के. फ्लैट तरफा Dynal L10 1 मिलीग्राम से युक्त ट्यूब प्रत्येक तरल के 5 मिलीलीटर मात्रा स्थानांतरण 10X SL-बफर एक और बी SL-बफर 10X शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब अभिकर्मक पानी की 2.5 मिलीलीटर के साथ दो बार और कुल्ला कुल्ला जोड़ने के प्रत्येक L10 ट्यूब, L10 ट्यूब से 12 मिलीलीटर में कुल मात्रा लाने बफ़र्स सहित. L10 ट्यूब 100 μl अच्छी तरह से मिश्रित resuspended विरोधी cryptosporidium और विरोधी Giardia Dynabeads की प्रत्येक जोड़ें. 18 rpm पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक अंग को घुमानेवाली पेशी मिक्सर पर L10 ट्यूब घुमाएँ. चुंबक MPC-6 और धीरे हाथ रॉक अंत करने के लिए अंत ट्यूब, 2 मिनट के लिए 180 ° के खिलाफ L10 ट्यूब के फ्लैट की ओर रखें. चुंबक MPC-6 में चुंबक पक्ष के साथ L10 ट्यूब को ध्यान में रखते हुए, सतह पर तैरनेवाला दूर पसाना / मनका (ऊ) पुटी परिसरों Bou सेचुंबक के लिए एन डी. चुंबक से L10 ट्यूब निकालें और एक ट्यूब SL-बफर 1X के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें. 1X का 0.5 मिलीग्राम की दो अतिरिक्त rinses का उपयोग एक 1.5 मिलीग्राम microcentrifuge ऊर्ध्वाधर स्थिति में चुंबक के साथ MPC-एस में आयोजित ट्यूब में एक घंटे के बफर निलंबन स्थानांतरण. धीरे चुंबक MPC-एस 180 ° में 1 मिनट के लिए ट्यूब रॉक. जगह में चुंबक के साथ, एक पाश्चर microcentrifuge ट्यूब के नीचे करने के लिए निर्देशित किया. पिपेट का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन). Microcentrifuge ट्यूब के सामने की ओर 1X पीबीएस के 1 मिलीग्राम, चुंबक हटाने और ट्यूब धीरे बस रॉक तक मोती resuspended कर रहे हैं. ऊर्ध्वाधर स्थिति में चुंबक बदलें और धीरे 1 मिनट के लिए ट्यूब 180 ° रॉक. महाप्राण (व्यंजन) पीबीएस मनका गोली परेशान बिना कुल्ला, एक पाश्चर विंदुक का उपयोग करने के लिए संभव के रूप में ज्यादा मलबे के रूप में दूर. चुंबक निकालें और microcentrifuge ट्यूब के पीछे की ओर अभिकर्मक पानी के 50 μl जोड़ें. 50 सेकंड के लिए पूर्ण गति, भंवर में ट्यूबफिर 80 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक 30 दूसरा भंवर के बाद ट्यूब सेते हैं. MPC-एस में slanted स्थिति में चुंबक, बदलें चुंबक को मोती बंधन और तरल में अल्सर (ऊ) को छोड़कर. (ऊ) पुटी निलंबन एक SingleSpot अच्छी तरह से स्लाइड पर लागू करें. 2.10 कदम दोहराएँ, एक ही अच्छी तरह से पहले हदबंदी युक्त तरल लागू करने. एक डिग्री सेल्सियस स्लाइड 1 घंटे के लिए गर्म करने के लिए अच्छी तरह से स्लाइड निलंबन सूखी 37 पर जगह स्लाइड. 3. धुंधला हो जाना और परीक्षा Buffers और समाधान की तैयारी: कार्य DAPI समाधान: DAPI स्टॉक समाधान के लिए 1X पीबीएस के 25 मिलीलीटर (2 / मेथनॉल में मिलीग्राम मिलीग्राम) के 25 μl जोड़ें. स्टोर स्टॉक और 1 डिग्री सेल्सियस और 10 ° अंधेरे में सी के बीच काम कर रहे समाधान. अच्छी तरह से स्लाइड मेथनॉल के 50 μl लागू करें और यह कमरे के तापमान पर शुष्क करने की अनुमति देते हैं. काम अच्छी तरह से स्लाइड के लिए DAPI समाधान के 50 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए सेते हैं. एक Kimwi का प्रयोग करेंपे अच्छी तरह से DAPI बाती. EasyStain की 50 μl लागू करें. 35 ° सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं. बाती एक Kimwipe के साथ अच्छी तरह से दाग, और फिर धीरे धीरे ठंड EasyStain फिक्सिंग बफर के 300 μl जोड़ने के लिए, यह अच्छी तरह से किनारे पर प्रवाह करने की अनुमति देता है. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए सेते हैं. अच्छी तरह से बफर बाती और लागू EasyStain बढ़ते मध्यम के 10 μl एक Kimwipe का उपयोग करें. ध्यान से एक कवर पर्ची लागू करने के लिए, किसी भी बुलबुले होते हैं कि को हटाने. स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवर पर्ची सील. स्कैन पूरे FITC फिल्टर का उपयोग कर, 200X कुल बढ़ाई ovoid या गोलाकार सेब हरी फ्लोरोसेंट वस्तुओं है कि एक oocyst या पुटी सदृश स्लाइड. भी से 1000x कुल बढ़ाई, तो पर 1000x कुल बढ़ाई DAPI फिल्टर के साथ और डीआईसी के साथ सभी तरह की वस्तुओं की जांच करते हैं. एक calibrated नेत्र सुक्ष्ममापी और morphological विशेषताओं का उपयोग कर आकार रिकार्ड. दस्तावेज़ परिणाम. नोट: अतिरिक्त सूचनाओंमूल प्रक्रिया के बारे में सूचना EPA के 1623 विधि 12 के दिसंबर 2005 के संस्करण में पाया जा सकता है. स्पज्या का प्रवाह ultrafiltration खोखला फाइबर वर्णित प्रक्रिया EPA के विधि 1623 की धारा 12.0 के स्थान पर प्रयोग किया जाता है. गर्मी हदबंदी EPA के विधि 1623 की धारा 13.3.3 संशोधित. प्रक्रिया भी बताता है कि एक अतिरिक्त पीबीएस आईएमएस प्रक्रिया के दौरान जो में 13.3.2.16 अनुभाग के बाद विधि 1623 के दिसंबर 2005 के संस्करण में डाला जा सकता है कुल्ला. उपभोज्य, अभिकर्मकों और उपकरण EPA इन संशोधनों सहित 1623 विधि के लिए इस्तेमाल की पूरी सूची उपकरण सूची में सूचीबद्ध है. 4. प्रतिनिधि परिणाम Cryptosporidium oocysts और Giardia अल्सर निस्पंदन और immunomagnetic जुदाई की प्रक्रिया के माध्यम से बरामद सूक्ष्म विश्लेषण से पता चला रहे हैं. 200X कुल बढ़ाई पर, प्रत्येक जीव एक ठेठ धुंधला पैटर्न, आकार, और आकार के प्रदर्शन के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया </stronछ> आगे जा पर 1000x कुल बढ़ाई तेल विसर्जन का उपयोग कर मनाया जाना चाहिए. यह माप और या तो ठेठ परिभाषित सुविधाओं या atypical विशेषताएं है कि सकारात्मक पहचान शासन की पहचान के लिए अनुमति देने के cryptosporidium गोलाकार वस्तु एक ovoid है. व्यास में 4 से 6 माइक्रोन जो चमकते प्रकाश डाला (चित्र 3A किनारों के साथ शानदार सेब हरी FITC प्रतिदीप्ति प्रदर्शन ). एक हरे रंग की रिम और कोई अलग नाभिक (नकारात्मक DAPI), तीव्र नीले आंतरिक धुंधला हो जाना, या करने के लिए चार अलग, नाभिक नीले आकाश (DAPI के साथ नीले रंग की आंतरिक धुंधला प्रकाश DAPI यूवी के साथ, एक oocyst निम्नलिखित विशिष्ट सुविधा श्रेणियों में से एक प्रदर्शन करेंगे सकारात्मक – 3B चित्रा). Atypical सुविधाओं को रंग, संरचना, या DAPI प्रतिदीप्ति (जैसे, भी कई दाग नाभिक, लाल आंतरिक संरचना fluorescing) में विचलन शामिल हैं. यदि फ्लोरोसेंट वस्तु ठेठ FITC और DAPI धुंधला के लिए मापदंड से मुलाकात की है, यह अंतर हस्तक्षेप चोर का उपयोग कर जांच की हैTRAST (डीआईसी). वस्तु कोशिका दीवार अलंकरण, या एक या दो बड़े सेल भरने नाभिक के रूप में atypical बाह्य या आंतरिक लक्षण के लिए जांच की है. यदि अटीपिकल संरचनाओं नहीं मनाया जाता है, वस्तु कुल आइएफए गिनती में दर्ज की गई है और एक खाली अनाकार संरचना के रूप में या 1-4 वर्तमान स्पोरोजोएट्स (चित्रा -3 सी) के साथ वर्गीकृत है. इसी तरह, Giardia तरह की वस्तुओं FITC और DAPI के रूप में अच्छी तरह के रूप में धुंधला axonemes, मंझला निकायों, और नाभिक की तरह डीआईसी विशेषताओं, के संबंध में जांच कर रहे हैं Giardia अल्सर ovoid सेब हरी शानदार वस्तुओं, 8 दौर के लिए कर रहे हैं. 18 तक 5 माइक्रोन 15 माइक्रोन चमकते प्रकाश डाला किनारों (चित्रा 3 डी) के साथ विस्तृत. DAPI यूवी के साथ, Giardia पुटी DAPI नकारात्मक धुंधला हो जाना, या DAPI सकारात्मक विशेषताओं (चित्रा 3E) प्रदर्शन करेंगे. फ्लोरोसेंट वस्तु एक ही तरीके में विशिष्ट और atypical सुविधाओं के लिए जिला उद्योग केंद्र द्वारा जांच की है cryptosporidium के लिए वर्णित के रूप में.यदि अटीपिकल सुविधाओं नहीं मनाया जाता है, वस्तु कुल आइएफए गिनती में दर्ज की गई है और खाली युक्त अनाकार संरचना के रूप में, या आंतरिक वर्तमान संरचना (3F चित्रा) की एक या एक से अधिक प्रकार के साथ वर्गीकृत है. अटीपिकल विशेषताएं हैं करने के लिए मनाया जाता है किसी भी जीव है कि एक पुटी (ऊ) के रूप में नहीं गिना जाना चाहिए. पर्यावरणीय नमूनों की सूक्ष्म विश्लेषण को चुनौती के रूप में वहाँ जीव है कि ऑटो प्रतिदीप्ति या पार है FITC – संयुग्मित विरोधी cryptosporidium और / या विरोधी Giardia एंटीबॉडी के एक साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं. यह अनुशंसित है कि एक विश्लेषक जलीय रोगाणुओं और स्लाइड्स की समीक्षा दर्जनों cryptosporidium और Giardia पहचान अनुभव हासिल करने के साथ परिचित हो (ऊ) के कम से कम तीन सकारात्मक धुंधला नियंत्रण स्लाइड पर अल्सर माइक्रोस्कोप में हर सत्र से पहले लक्षण वर्णन किया जाना चाहिए. गुणवत्ता नियंत्रण के नमूने (ऊ) अल्सर के साथ बालीदार प्रतिशत आरईसी का निर्धारण किया जा सकता हैप्रत्येक गणना का उपयोग प्रोटोजोआ के लिए Overy: (ऊ) पुटी प्रतिशत रिकवरी = ((QC नमूना गणना Unspiked नमूना से गणना) / स्पाईक) x 100. चित्रा 1 स्पज्या का प्रवाह ultrafiltration खोखला फाइबर प्रणाली के ग्राफिक प्रतिनिधित्व. टयूबिंग सहायता कोडित रंग प्रणाली की विधानसभा है. चित्रा 2 प्रतिनिधि cryptosporidium और Giardia अल्सर (ऊ) की छवि प्रतिदीप्ति. Cryptosporidium oocysts और Giardia अल्सर FITC लेबल विरोधी cryptosporidium / Giardia एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे. तीर, अल्सर Giardia, तीर, cryptosporidium oocysts. चार cryptosporidium oocysts और छह Giardia अल्सर का एक कुल ध्यान केंद्रित करने के विमान में पाया गया. नमूने observएड के तहत 200X बढ़ाई. चित्रा 3 के cryptosporidium oocysts और Giaridia अल्सर लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियों cryptosporidium oocysts (ए सी). प्रतिभाशाली सेब हरी चमकीले प्रकाश डाला (ए) के किनारों को चार अलग, नीले आकाश DAPI (बी) के नाभिक और oocyst प्रति एक से चार स्पोरोजोएट्स (एस) (सी) युक्त के साथ व्यास में गोलाकार 4-6 माइक्रोन वस्तुओं के FITC प्रतिदीप्ति. Giardia अल्सर (डी एफ). प्रतिभाशाली ovoid वस्तुओं दौर 8 सेब हरी FITC प्रतिदीप्ति – 18 तक 5 माइक्रोन – 15 चमकते प्रकाश डाला (डी) किनारों चार आसमानी DAPI नाभिक (ई) से युक्त के साथ और एक या एक से अधिक discernable आंतरिक ऐसी संरचना के साथ एक विस्तृत माइक्रोन (एन) के नाभिक के रूप में, मंझला शरीर (एम) और या axonemes (ए) (एफ). सफेद तीर, शानदार सेब हरे प्रतिदीप्ति धुंधला cryptosporidium oocysts और Giardia अल्सर डब्ल्यूalls, सफेद तीर, DAPI सकारात्मक नाभिक. नमूने 1000x बढ़ाई के तहत मनाया.
Discussion
स्पज्या का प्रवाह खोखला फाइबर ultrafiltration के cryptosporidium oocysts और पानी से Giardia अल्सर की प्रारंभिक एकाग्रता के लिए एक वैकल्पिक और प्रभावी तकनीक है. खोखला फाइबर ultrafiltration परंपरागत फिल्टर की तुलना में कम खर्चीला है. चूंकि यह के cryptosporidium oocysts और Giardia अल्सर के विभिन्न पानी matrices के एक विभिन्न प्रकार से ध्यान केंद्रित करने की क्षमता है यह वर्तमान निस्पंदन EPA के विधि 1623 के लिए तकनीक का इस्तेमाल करने के लिए एक उपयोगी विकल्प है. सबसे अन्य निस्पंदन तरीकों के साथ के रूप में, खोखला फाइबर ultrafiltration बहुत turbid नमूनों के साथ दूषण की संभावना है. उच्च दबाव पानी फिल्टर दूषण से नतीजा होगा, इसलिए यह छानने का काम चलाने के दौरान दबाव की निगरानी के लिए सिफारिश की है. Cryptosporidium oocysts और Giardia अल्सर के अलावा, खोखला फाइबर ultrafiltration बैक्टीरिया और वायरस 1-3,5,8 ध्यान केंद्रित करने में सक्षम हो दिखाया गया है. खोखला फाइबर ultrafiltration ओइस विधि में utlined एक एकल नमूने में कई जीवों को ध्यान केंद्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह उल्लेखनीय है कि 200 और 250 मिलीलीटर के बीच अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए कि अतिरिक्त centrifugation कदम तो महत्वपूर्ण एकाग्रता प्रक्रिया में अंतिम कदम है, कि (ऊ) पुटी हानि में परिणाम कर सकते हैं कर रहे हैं (2.2 कदम) बचा है. हालांकि, बोतल में मात्रा भी कम ड्रॉप करने के लिए अनुमति वसूली पर प्रतिकूल प्रभाव के बाद से वहाँ पर्याप्त तरल के लिए retentate बोतल में सभी oocysts या अल्सर को मजबूर मात्रा नहीं होगा. इसलिए यह 200 और 250 मिलीलीटर के बीच अंतिम मात्रा को बनाए रखने की सिफारिश की है.
गर्मी पृथक्करण विधि 1623 में एसिड हदबंदी कदम के लिए एक विकल्प है. इस वैकल्पिक कदम के के cryptosporidium oocyst वसूली में सुधार लाने के लिए और जब भी नदी या अभिकर्मक 9 पानी से अलग विधि भिन्नता को कम दिखाया गया है. एसिड और गर्मी हदबंदी तरीकों का एक पक्ष द्वारा साइड तुलना दिखा दिया कि dissocia करने के लिए गर्मी का उपयोगते immunomagnetic मोती से जीवों दोनों cryptosporidium और Giardia के लिए उच्च मतलब वसूली का उत्पादन. इसके अलावा, cryptosporidium और Giardia वसूली की सटीक गर्मी हदबंदी साथ संसाधित नमूनों में एसिड हदबंदी 9 के साथ तुलना में बेहतर था.
एकाग्रता कदम के रूप में HFUF का समावेश करने के लिए कई जीवों को ध्यान केंद्रित करने की क्षमता प्रदान करके अधिक लचीलापन देता है. इसके अलावा यह वर्तमान विधि 1623 निस्पंदन विकल्प के लिए एक कम महंगा विकल्प है.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपने तकनीकी सहायता के लिए इस पांडुलिपि और डौग हैमिल्टन में महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए एन ग्रिम और माइकल Zimmerman धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Equipment/Reagent | Vendor | Catalog # |
| Asahi Kasei Rexeed 25 S/R wet hollow-fiber ultrafilters | Dial Medical | REXEED25S/R |
| I/P 73 (Masterflex R-3603), or equivalent | Cole Parmer | EW-06408-73 |
| L/S 24 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-24 |
| L/S 15 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-15 |
| L/S 36 (Masterflex Platinum-Cured), or equivalent | Cole Parmer | EW-96410-36 |
| I/P Precision Brushless Drive | Cole Parmer | EW-77410-10 |
| I/P Easy Load Pump Head | Cole Parmer | EW-77601-10 |
| Black HDPE Tee, 1/4″x 3/8″ x 3/8″ | US Plastics | 62064 |
| Masterflex T-connector L/S 15-25 | Cole Parmer | EG-30613-12 |
| Nalgene heavy-duty pp 1 L bottle | Cole Parmer | EW-06257-10 |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11C |
| Nalgene filling/venting cap for 1/4″ tubing, 53B | Cole Parmer | EW-06258-10 |
| Pressure gauge | Cole Parmer | A-680-46-10 |
| Straight coupling, NPT(F), 1/4″ | Cole Parmer | EW-06469-18 |
| NPT branch tee, natural pp | Cole Parmer | A-30610-75 |
| Pinch clamps, 1/2″ | Cole Parmer | EW-06833-00 |
| Custom fit DIN adapters | Molded Products Corp | MPC-855NS.250 |
| Ring stand | Fisher Scientific | 14-670B |
| Ring stand clamps | Fisher Scientific | 05-769-6Q |
| Keck ramp clamp, 14mm | Cole Parmer | EW-06835-10 |
| Sodium polyphosphate | Sigma Aldrich | 305553 |
| Sodium thiosulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | 72050 |
| Antifoam Y-30 emulsion | Sigma Aldrich | A5758 |
| Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 |
| 10 L Collapsible high-density polyethylene cubitainer | VWR | IR314-0025 |
| Centrifuge bottle rack | Fisher Scientific | 05-663-103 |
| 250 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430776 |
| Disposable funnel | Cole Parmer | U-6122-10 |
| Wash bottle | Cole Parmer | U-06252-40 |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R |
| Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ARIES SX4750 |
| Centrifuge bucket adapters for 250 ml conical tubes | Beckman Coulter | 349849 |
| 200 μl large bore pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-134 |
| VacuShield Filter | Gelman | 629-4402 |
| 5 ml pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11D |
| Dynabeads: Cryptosporidium/Giardia combo kit | IDEXX | 73002 |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Falcon | 352098 |
| Dynal L10 flat sided tubes | IDEXX | 74003 |
| Timer | VWR | 23609-202 |
| Dynal MPC-6 magnet | IDEXX | 12002D |
| 1 ml pipettes | VWR | 53283-700 |
| 1.5 ml low adhesion microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 |
| 1000 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P1000/DF1000ST |
| 100 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P100/DF100ST |
| 9 inch Pasteur pipettes | VWR | 14672-412 |
| Dynal MPC-S magnet | IDEXX | 12020D |
| Vortex | VWR | 14216-188 |
| Dynabeads rotator mixer | IDEXX | 94701 |
| Heat block | Fisher Scientific | 11-718-2 |
| Lab Armor Beads | Lab Armor | 42370-750 |
| Digital thermometer | Fisher Scientific | 15-077-60 |
| Phosphate-buffer saline 1X pH 7.4 (1X PBS) | Sigma | P4417 |
| Single Spot slides | IDEXX | 30201 |
| Cover glass | Corning | 287018 |
| EasyStain direct kit | BTF | – |
| 10 μl pipette & corresponding barrier tips | Gilson | P10 & DF10ST |
| 4′,6′-Diamidino-2-phenyl indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | S30697 |
| Methanol | Fisher Scientific | L6815 |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 |
| Incubator | Boekel Scientific | 133000 |
| slide warmer | Fisher Scientific | 11-474-521 |
| Immersion oil, Type A ND= 1.515 | Nikon | MXA20234 |
| Nikon 90i microscope with DIC capabilities | Nikon | MBA 77000 |
| Plan APO 100X oil objective | Nikon | MRD01901 |
| Plan Achro 20X | Nikon | MRL00202 |
| FITC filter | Nikon | 96302 |
| DAPI filter | Nikon | 96301 |
| X-cite fluorescence illuminator | Nikon | 87540 |
| Lens paper | Nikon | 76997 |
| Biohazard disposable bag | Fisher Scientific | 01-829D |
| Biohazard sharps container | Fisher Scientific | 14-827-117 |
| 3 % hydrogen peroxide | VWR | BDH3540-2 |
| Bleach | Fisher Scientific | 1952030 |
| Wypall | Kimberly Clark | 34790 |
Riferimenti
- DiGiorgio, C. L., Gonzalez, D. A., Huitt, C. C. Cryptosporidium and Giardia recoveries in natural waters by using Environmental Protection Agency Method 1623. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5952 (2002).
- Hill, V. R., Kahler, A. M., Jothikumar, N., Johnson, T. B., Hahn, D., Cromeans, T. L. Multistate evaluation of an ultrafiltration-based procedure for simultaneous recovery of enteric microbes in 100-liter tap water samples. Appl. Environ. Microbiol. 73, 4218-4225 (2007).
- Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Hahn, D., Narayanan, J., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Amburgey, J. E. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6878-6884 (2005).
- Hill, V. R., Polaczyk, A. L., Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Hahn, D., Amburgey, J. E. Comparison of hollow-fiber ultrafiltration to the USEPA VIRADEL technique and USEPA method 1623. J. Environ. Qual. 38, 822-825 (2009).
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- Lindquist, H. D., Harris, S., Lucas, S., Hartzel, M., Riner, D., Rochele, P., Deleon, R. Using ultrafiltration to concentrate and detect Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus subspecies globigii, and Cryptosporidium parvum in 100-liter water samples. J. Microbiol. Methods. 70, 484-492 (2007).
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- Zuckerman, U., Tzipori, S. Portable continuous flow centrifugation and method 1623 for monitoring of waterborne protozoa from large volumes of various water matrices. J. Appl. Microbiol. 100, 1220-1227 (2006).
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Modified EPA Method 1623Tangential Flow Hollow-fiber UltrafiltrationHeat DissociationWaterborne CryptosporidiumGiardia Spp.ProtozoaDiarrheal Disease OutbreaksPrevalenceMonitoringUS Drinking Water SuppliesSample ConcentrationImmunomagnetic Separation ProcedureAcid Dissociation ProcedureImmunofluorescence Staining And EnumerationEnvirochek FiltersEnvirochek HV FiltersFilta-Max Filters
Citazione di questo articolo
Rhodes, E. R., Villegas, L. F., Shaw, N. J., Miller, C., Villegas, E. N. A Modified EPA Method 1623 that Uses Tangential Flow Hollow-fiber Ultrafiltration and Heat Dissociation Steps to Detect Waterborne Cryptosporidium and Giardia spp.. J. Vis. Exp. (65), e4177, doi:10.3791/4177 (2012).