절연 골격근의 수축성, Fatigability 및 Alternans의 예 VIVO 평가

Summary

우리는 직접의 근육 힘, 근육 힘, 수축성 속도론 및 절연 골격 근육의 fatigability를 측정하는 방법을 설명<em> 체외에서</em> 입력란을 자극을 사용하여 시스템을 갖추고 있습니다. 칼슘에 대한 중요 정보^{2 +} 취급 속성과 근육의 수축성 기계는 다른 자극 프로토콜을 사용하여 얻을 수 있습니다.

Abstract

여기에 설명하는 것은 분리 된 골격 근육의 수축성을 측정 할 수있는 방법입니다. 이러한 근육 힘, 근육 전력, 수축성 속도론, fatigability, 그리고 피로 후 복구와 같은 매개 변수가 같은 흥분으로 여기 – 수축 결합의 특정 측면 (ECC) 프로세스, 수축성 기계 및 칼슘 ^{2 +} 처리 능력을 평가하기 위해 얻을 수 있습니다. 이 방법은 신경과 혈액 공급을 제거하고 격리 골격근 자체에 초점을 맞추고 있습니다. 우리는 정기적으로 변조 칼슘 ^{2 +} 신호 경로 불구하고 골격 근육의 수축 속성을 변경 유전자 구성 요소를 식별하는 데이 방법을 사용합니다. 여기, 우리는 체외 근육 수축성 분석에 사용 얻을 수 다양하고 풍부한 정보의 예로서 새로 확인 된 골격 근육 표현형, 즉 메카닉 alternans를 설명합니다. 단일 셀 assays, 유전자 접근 방식과 biochemi와 함께 검정의 조합stry의 assays는 골격근의 ECC의 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

Introduction

골격 근육은 중추 신경계의 통제하에 수축성 힘을 뼈대의 뼈에 연결하고 생성합니다. 여기 – 수축 결합 (ECC)는 기계 응답에 전기 자극으로 변환하는 과정을 말합니다. 칼슘 ^{2 +} 신호는 골격근의 수축 기능의 필수 구성 요소입니다. 효과적인 칼슘 ² 근 소포체 (SR)에서 ⁺ 동원은 중요한 근육 세포 ^{1, 2에서} ECC를위한 구성 요소와 세포 ^칼슘이의 변화 ⁺ 신호는 근육 질환 ^3-5의 숫자에 해당 수축 기능 장애를 기초입니다. 근육 수축성의 적절한 평가는 ⁺ 이미지와 다른 assays가 아니라 수축성 수준에서, 골격근 기능에 통찰력을 얻을뿐만 아니라, 운동 수준에하는 것이 필수적 및 CA ² 무료로 제공됩니다. 힘과 속도도의 중요한 속성을 알려 구할 수 있습니다다른 생리학 및 pathophysiological 조건 하에서 근육 전력 및 ECC 프로세스의 상태를 표시합니다.

연구의이 다산의 필드는 매우 풍부한 역사를 가지고 있으며 근육 수축의 많은 이론은 두 천년 ^6으로 나타났다. 현대 근육 연구는 아마도 레벤후크 ⁶ 근육 섬유의 크로스 – 강선과 myofibrils의 현미경 관찰과 1674년에서 1682년까지에서 시작됩니다. 의 신경이 먼 전기 기계 ^7-9에서 스파크 방전시 메스와 접촉 할 때 거의 100 년 후, 루이지 Galvani는 개구리 근육 계약을 힘차게 그 관찰했다. 수축은 금속 전도체를 통해 근육에 다리 신경을 연결하여 생산 될 수 있습니다. Galvani에 의해지지 복잡한 전기 신호 메커니즘의 세부 사항은 결국 전기 생리학의 기초가되었다 자신의 유명한 방정식 ^{10, 11} 호 지킨, 헉슬리와 카츠에 의해 공식화되었다. 린의 놀라운 관찰GER은 ⁺ 개구리 심장과 골격 근육 ^12-15의 수축성에 대한 세포 칼슘 ^(2)의 효과에 칼슘 ² 인식의 첫 번째 주요 단계 ⁺ 근육 수축성 ^{16, 17의} 핵심 레귤레이터로를 나타냅니다. 1980 년대부터 현재에 이르기까지 근육 수축성 필드에 발견 버스트 인해 근육 수축성과 손쥐 골격근 ¹⁸ fatigability 프로토콜의 도입으로 실현되었다. 존스와 에드워즈는 ^19이 ECC 기계의 변화와하지 수축성 장치와 연결되었다고 저주파 간헐적 인 피로 (힘의 운동 유발 성 감소)를 제안하는 첫번째이었다. 동안 후반 1980 년대와 초기 1990 년대에 Kolkeck 외 ²⁰ Kolbeck 및 Nosek ^21,와 리드 ^(22)는, 골격 근육 수축성에 theophyllines, cortiosterone, 무료 래디칼의 효과를 연구하기 위해 쥐 모델에서 격막 근육을 사용했다 브룩스 Faulkn어 쥐 ²² 빠른 및 느린 근육의 반복 힘 및 전력 측정의 측정에보고 처음이었다. 또한, Lannegren, Westerblad, 양고기, 그리고 Westerblad 직접 세포 칼슘 ^{2 +} 규제로 전직 생체의 수축성을 연결하는 첫 번째 있었고, 근육의 피로 ^{23, 24의} 산증의 역할에 의문을 제기 시작했다.

우리 실험실이 크게 손상 마우스 근육 수축성 연구의 조합을 사용하여 초기 2000 년대 소설 유전자의 이해에 대한 modulatory 및 규제 역할과 근육 ECC에서 근육 수축성, fatigability, 그리고 노화에 중요한 역할과 이후 공헌 세포 칼슘 ^{2 +} 모니터링에있다 온전하고 피부 근육 섬유와 분자 – 유전자 조작 ^{3-5, 25-29.}

여기 손쥐 절연 soleus과 신근 digitorum longus의의 측정 수축성 (ED에 대한 실험 프로토콜을 설명에 해당하는 L) 근육, 대부분 느린 산화 (타입 I과 IIA 근육 섬유)와 별개의 수축 특성을 가진 대부분 빠른 속도로 glyocolytic 근육 (타입 IIB와 IIx 근육 섬유).에게 이 프로토콜에서 그대로 근육 힘줄이 단지는 격리 된 순수 산소 또는 산소의 혼합 (95 %)과 CO ₂ (5 %) 중 함께 제공 ADI PowerLab Radnotti 챔버 시스템에 목욕. 수축성 힘은 잔디 stimulator에서 전기 stimulations에 의해 생성 및 매크로 루틴의 정의는 데이터의 수집, 수집, 디지털화, 스토리지를 제어 할 수 있습니다 ADI PowerLab/400 시스템과 통합 된 힘 변환기를 사용하여 감지되었습니다. 이 설정은 근육 힘, 근육 전원뿐만 아니라 힘이 대 주파수 관계, 근육 피로, 근육 피로, 속도, 근육 수축의 전체 운동 속성의 복구를 측정 할 수 있습니다. 또한, 근육 수축에 마약의 효과는이 실험을 통해 모니터링 할 수 있습니다. </p>

이 방법의 장점은 근육을 계약의 본질적인 속성의 직접 평가를 수 있도록 골격 근육에서 떨어져 neuronal과 혈관 구성 요소를 제거에 누워. 또한, 전 생체의 수축성의 assays는 다양한 이온 투과 채널과 수송의 약리 조작 골격근 기능을 위해 생리적 역할을 정의하기 위해 사용을 가능하게 고립 된 근육을 둘러싸고있는 세포 환경의 조작을 할 수 있습니다.

이 예 생체 시스템은 우리가 최근에 변경된 세포 칼슘 ^2로 연결 한 특정 돌연변이 근육 준비에 뚜렷한 alternan의 행동 ⁺ 등록 할 ⁴ 취급을 발견 할 수있다. Alternans은 피곤하게하는 프로필의 감소 단계에서 수축성 힘의 변동 버스트 에피소드로 정의됩니다. 이 이벤트에는 수축성 힘이 순간적으로 힘 D의 이전 수준보다 증가더 많은 칼슘 ^{2 +} 출시되고 또는 수축성 기계는 칼슘 ^{2 + 30} 더 민감되었다 어느 아마도 때문에 피곤하게하는의 자극을 uring. cyclopiazonic 산 (CPA), 근 – endoplasmic 소포체 칼슘 ATPase (SERCA), 카페인, ryanodine 채널 (RyR)의 작용제의 회복 차단의 치료와 stimulations를 피곤하게하는 반복이 모든 것을 alternans 직접 관련된 제안, 기계 alternans에게 ⁴ 일으킬 수 EC 커플 링 프로세스의 변조. 체외 수축성 설정에서의 메카닉 alternans를 유도하고 기록 할 수있는 방법의 시연은 개별 연구 관심 분야에 따라이 시스템 또는 유사한 것들로 획득 할 수 다양한 실험 매개 변수를 표시 할 수있는 예제로 제공하고 있습니다.

이 방법은 근육 생리학을 공부 연구자에 관심이있을 것으로 생각됩니다. 비슷한 설정은 다른에서 격리 된 골격 muscle-tendon/ligament 단지 사용할 수 있습니다해부학 적 위치,뿐만 아니라 단일 섬유와 근육 스트립​​에 있습니다.

Protocol

솔루션 구성 : 2.5 MM 칼슘 2 + Tyrode 용액 : 140 MM NaCl, 5 MM KCl, 10 MM의 HEPES, 2.5 MM CaCl 2, 2 MM MgCl 2, 10 MM 포도당 0 MM 칼슘 2 + Tyrode 용액 : 140 MM NaCl, 5 MM KCl, 10 MM의 HEPES, 2 MM MgCl 2, 0.1 MM의 에틸렌 글리콜 tetraacetic 산 (EGTA), 10 MM 포도당 참고 : 입욕 솔루션은 위의 솔루션을 사용하는 경우하지만, 5 % CO 2</su…

Discussion

수축성 힘과 fatigability의 측정은 골격근 기능의 전반적인 평가하는 것이 중요합니다. 이 분석의 주요 목적은 sarcopenia 및 근육의 피로와 같은 특정 병적 인 조건에서 근육 힘의 변화와 피곤하게하는 속성을 식별하고, 근육 수축성에 마약 / 시약의 효과를 테스트하는 것입니다. 근육 힘이 밀접하게 세포 칼슘 ² 관련되어 있기 때문에 ⁺ 릴리스 세포 칼슘 ^{2 +} 항목과이 둘 사이의…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg – 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5