Ex Vivo Beoordeling van contractiliteit, vermoeidheid en alternantie in geïsoleerde skeletspieren

Summary

We beschrijven een methode om direct te meten spierkracht, spierkracht, contractiele kinetiek en vermoeidheid van geïsoleerde skeletspieren in een<em> In vitro</em> Systeem met behulp van veld stimulatie. Waardevolle informatie over Ca^{2 +} Hanteren eigenschappen en contractiele machines van de spier kan worden verkregen met behulp van verschillende stimulerende protocollen.

Abstract

Hier beschreven is een methode om contractiliteit van geïsoleerde skeletspieren meten. Parameters zoals spierkracht, spierkracht, contractiele kinetiek, vermoeidheid, en herstel na vermoeidheid kan worden verkregen tot specifieke aspecten van de excitatie-contractie koppeling (ECC) proces, zoals prikkelbaarheid, contractiele machines en Ca ^{2 +} wendbaarheid te beoordelen. Deze methode verwijdert de zenuw en bloedtoevoer en richt zich op de geïsoleerde skeletspieren zelf. We routinematig gebruik van deze methode om genetische componenten die de contractiele eigendom van de skeletspieren te veranderen hoewel modulerende Ca ^{2 +} signaalwegen te identificeren. Hier beschrijven we een nieuw geïdentificeerde skeletspier fenotype, dat wil zeggen mechanische alternantie, als voorbeeld van de diverse en rijke informatie die kan worden verkregen met de in vitro assay spierflexibiliteit. Combinatie van deze assay met enkele cel assays, biochemische en genetische benaderingenstry assays kunnen belangrijke inzichten in de mechanismen van ECC in skeletspieren.

Introduction

Skeletspieren hechten aan botten van het skelet en contractiele krachten te genereren onder de controle van het centrale zenuwstelsel. Excitatie-contractie koppeling (ECC) verwijst naar het proces van het omzetten van een elektrische stimulus op een mechanische respons. Ca ^{2 +-signalering} is een essentieel onderdeel van de contractiele functie in skeletspieren. Effectieve Ca ^{2 +} mobilisatie van sarcoplasmatisch reticulum (SR) is een belangrijke component voor ECC in spiercellen ^{1, 2,} en veranderingen in intracellulaire Ca ^{2 +} signalering de desbetreffende contractiele disfunctie grondslag liggen in een aantal spierziekten ^3-5. Goede beoordeling van de spier contractiliteit is essentieel en complementair aan Ca ^{2 +} imaging en andere tests om inzicht te krijgen in de skeletspier functie, niet alleen op de contractiele niveau, maar ook op de kinetische niveau. Kracht en snelheid kan ook worden verkregen op de belangrijke eigenschap van de hoogtespierkracht en de status van de ECC proces onder verschillende fysiologische en pathofysiologische omstandigheden.

Dit vruchtbare gebied van onderzoek heeft een zeer rijke geschiedenis en vele theorieën van spiercontractie verscheen meer dan twee millennia ^6. Moderne spier onderzoek begint waarschijnlijk in 1674-1682 met de microscopische observatie van cross-strepen en myofibrillen in spiervezels door Leeuwenhoek ^6. Bijna een eeuw later, Luigi Galvani opgemerkt dat kikker spier samentrekt krachtig wanneer de zenuw wordt aangeraakt met scalpel tijdens een vonkontlading uit een ver elektrische machine ^7-9. Krimp kan ook worden vervaardigd door het verbinden van de poot zenuw naar de spier door een metalen geleider. De details van de complexe elektrische signaal-mechanisme bepleit door Galvani werden uiteindelijk geformuleerd door Hodgkin, Huxley en Katz in hun beroemde formule ^{10, 11,} dat werd de basis van elektrofysiologie. De opmerkelijke observaties van Ringer vertegenwoordigen over de effecten van extracellulaire Ca ^{2 +} op de contractiliteit van de kikker hart-en skeletspieren ^{12 tot 15} van de eerste grote stap in de erkenning van Ca ^{2 +} als een belangrijke regulator van de spier contractiliteit ^{16, 17.} Van de jaren 1980 tot heden een uitbarsting van ontdekkingen in het spierflexibiliteit veld werd gerealiseerd door de invoering van spierflexibiliteit en vermoeidheid protocols in murine skeletspieren ^18. Jones en Edwards waren de eersten die dat lage frequentie intermitterende vermoeidheid (door inspanning veroorzaakte vermindering van kracht) suggereren ¹⁹ werd geassocieerd met veranderingen in de ECC machines en niet het contractiele apparaat. In de late jaren 1980 en begin 1990 werden Kolkeck et al. ^20, Kolbeck en Nosek ²¹ en Reid ²² met behulp middenrif van diermodellen om de effecten van theophyllines, cortiosterone en vrije radicalen te bestuderen op skeletspieren contractiliteit, terwijl Brooks en Faulkner waren de eerste om te rapporteren over de metingen van herhaalde kracht en macht metingen in snel-en langzaam-spieren van muizen ^22. Daarnaast Lannegren, Westerblad, Lam en Westerblad waren de eersten die ex vivo contractiliteit direct te koppelen met intracellulaire Ca ^{2 +} regeling en begon vraagtekens bij de rol van acidose bij spiervermoeidheid ^{23, 24.}

Onze laboratoria hebben aanzienlijk bijgedragen sinds de vroege 2000's naar begrip van nieuwe genen met modulerende en regulerende functies op spier ECC cruciale rol in spierflexibiliteit vermoeidheid en veroudering door een combinatie van intacte muizen spierflexibiliteit studies, intracellulaire Ca ^{2 +} monitoring intact en huid spiervezels en moleculair-genetische manipulaties ^{3-5, 25-29.}

Hier hebben we gedetailleerd het experimentele protocol voor het meten van de contractiliteit van muizen-geïsoleerde soleus en m. extensor digitorum longus (EDL) spieren, die overeenkomen met een overwegend langzaam oxidatieve (type I en IIa spiervezels) en meestal snel glyocolytic spier (type IIb en IIx spiervezels) met verschillende contractiele eigenschappen. In dit protocol werden intacte spier-pees complexen geïsoleerd en gebaad in een ADI PowerLab Radnotti kamersysteem voorzien hetzij zuivere zuurstof of een mengsel van zuurstof (95%) en CO ₂ (5%). Contractiele krachten werden gegenereerd door elektrische prikkeling van een Gras stimulator en gedetecteerd met behulp van een krachtopnemer die is geïntegreerd met een ADI PowerLab/400 systeem, waardoor aanpassing van macro routines aan de verwerving, inning, digitalisering en opslag van gegevens te controleren. Deze configuratie meten spierkracht, spierkracht, evenals de kracht-frequentierelatie, spiervermoeidheid, herstel van spiervermoeidheid, snelheid en algemene kinetische eigenschappen van spiercontractie. Bovendien kunnen de effecten van geneesmiddelen op spiercontractie worden gecontroleerd door deze experimenten. </p>

Voordelen van deze werkwijze liggen in het verwijderen van de neuronale en vasculaire componenten weg van de skeletspieren, waardoor directe beoordeling van de intrinsieke eigenschappen van verdragsluitende spier. Bovendien ex vivo assays kunnen contractiliteit manipulatie van het extracellulaire milieu rond de geïsoleerde spieren, die het gebruik van farmacologische manipulatie van diverse permeatie ion kanalen en transporters om hun fysiologische functies definiëren skeletspierfunctie maakt.

Deze ex vivo systeem heeft ons toegestaan ​​om onlangs ontdekt een duidelijke alternan gedrag in bepaalde mutant spier preparaten, die werden gekoppeld aan veranderde intracellulaire Ca ^{2 +} verwerkingseigenschappen ^4. Alternans worden gedefinieerd als fluctuerende uitbarsting afleveringen van contractiele kracht tijdens de daling fase van de vermoeiend profiel. Tijdens deze evenementen contractiele krachten tijdelijk te verhogen boven het vorige niveau van kracht dijdens vermoeiend stimulatie, misschien omdat ofwel meer Ca ^{2 +} wordt losgelaten of de contractiele machine gevoeliger geworden voor Ca ^{2 + 30.} Behandeling van cyclopiazonic zuur (CPA), een reversibele blokker van sarcoplasmatisch-endoplasmatisch reticulum calcium ATPase (SERCA), cafeïne, een agonist van ryanodine kanaal (RyR) en herhaalde vermoeiend stimulaties kunnen allemaal leiden tot mechanische alternans ^4, wat suggereert dat alternans zijn direct gerelateerd aan modulatie van het EG koppelingsproces. Demonstratie van het te induceren en mechanische alternantie nemen in in vitro contractiliteit setup als voorbeeld de gevarieerde experimentele parameters die kunnen worden verkregen met dit systeem of soortgelijke, op basis van individuele onderzoeksinteresses tonen.

Deze methode kan van belang zijn voor onderzoekers bestuderen spierfysiologie. Gelijkaardige opstelling kan ook worden gebruikt voor geïsoleerde skelet muscle-tendon/ligament complexen van andereanatomische locaties, en voor enkelvoudige vezels en spierstrips.

Protocol

Oplossing samenstelling: 2,5 mM Ca 2 + Tyrode oplossing: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 en 10 mM glucose 0 mM Ca 2 + Tyrode oplossing: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 0,1 mM ethyleenglycol-azijnzuur (EGTA) en 10 mM glucose Opmerking: badoplossing worden verzadigd met 100% O 2 als met de bovenstaande oplossing, maar met 95% O <s…

Discussion

Meting van contractiele kracht en vermoeidheid is belangrijk voor de algehele evaluatie van de skeletspieren functie. Het belangrijkste doel van deze test is om veranderingen in spierkracht en vermoeiend eigenschappen onder bepaalde pathologische omstandigheden, zoals sarcopenie en spiervermoeidheid identificeren en het effect van drugs / reagentia op spierflexibiliteit testen. Aangezien de spierkracht is nauw verbonden met intracellulaire ^{Ca2 +} afgifte, ^{extracellulair} Ca2 ⁺ ingang en de…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg – 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5