Imaging Gliom Inledande<em> In Vivo</em> Genom en polerad och förstärkt Thin-skalle Kranial fönster
Summary
Genom att kombinera en polerad och förstärkt tunna skallen (portar) kraniell fönster och glioblastom (GBM) cellinjektion kan vi konstatera gliom initiering och tillväxt injicerade GBM celler i hjärnan på en levande mus i längdriktningen.
Abstract
Gliom är en av de mest dödliga formerna av human cancer. Den mest effektiva gliom behandling hittills-kirurgi följt av strålbehandling, erbjuder patienter endast blygsamma fördelar, eftersom de flesta patienter inte överlever mer än fem år efter diagnos på grund av gliom återfall 1,2. Upptäckten av cancer stamceller i humana hjärntumörer har förutsättningar för att ha en enorm inverkan på utvecklingen av nya terapeutiska strategier för gliom 3. Cancer stamceller definieras av sin förmåga både att själv förnya och att differentiera, och tros vara de enda celler i en tumör som har kapacitet att initiera nya tumörer 4. Gliom återfall efter strålbehandling tros härröra från motstånd gliom stamceller (GSCs) till terapi 5-10. In vivo är GSCs visas att bosätta sig i en perivaskulär nisch som är viktig för att upprätthålla sina stamceller-liknande egenskaper 11-14 . Centralt för organisationensering av generalsekretariatets nisch är vaskulära endotelceller 12. Befintlig data tyder på att GSCs och deras interaktion med vaskulära endotelceller är viktiga för tumörutveckling och identifiera GSCs och deras samverkan med endotelceller som viktiga terapeutiska mål för gliom. Förekomsten av GSCs bestäms experimentellt genom deras förmåga att initiera nya tumörer på ortotop transplantation 15. Detta uppnås typiskt genom att injicera ett visst antal GBM celler isolerade från humana tumörer i hjärnorna av allvarligt nedsatt immunförsvar möss, eller av mus GBM celler in i hjärnan hos kongena värdmöss. Analyser för tumörtillväxt utförs sedan efter tillräcklig tid för att tillåta GSCs bland injicerade GBM celler för att ge upphov till nya tumörer, typiskt flera veckor eller månader. Därför tillåter befintliga analyserna inte granskning av viktiga patologiska processen av tumör initiering från enskilda GSCs in vivo. Följaktligen viktigt insights i de specifika roller GSCs och deras interaktion med vaskulära endotelceller i de tidiga stadierna av tumör initiering saknas. Sådana insikter är avgörande för att utveckla nya terapeutiska strategier för gliom, och kommer att ha stora konsekvenser för att förebygga gliom återfall hos patienter. Här har vi anpassat portarna kranial fönster förfarande 16 och in vivo två-foton mikroskopi för att möjliggöra visualisering av tumörens initiering från injicerade GBM celler i hjärnan på en levande mus. Vår teknik kommer att bana väg för framtida insatser för att belysa de viktigaste signaleringsmekanismer mellan GSCs och vaskulära endotelceller under gliom initiering.
Protocol
Discussion
Nyckeln till en lyckad portar kraniell fönster är gallring och polering. Även om den ursprungliga gallring kan utföras snabbt, bör åtgärder vidtas för att säkerställa homogen förtunning av skallen över ett stort område. Vi tillämpar typiskt ett tunt skikt av saltlösning till skallen, och sedan tunn skallen ett pass vid en tidpunkt, så att saltlösningen avdunstar strax efter Microdrill har passerat över skallen gång. Det ger oss möjlighet att sakta men homogent ytterligare tunna skallen. En stadig han…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av The Jackson Laboratory Cancer Center Pilot Grant och The Maine cancerfonden.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM/F12(1:1) with Sodium Pyruvate | Thermo Sci Hyclone | SH3026101 | |
| B-27 Serum Free Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| GlutaMax-1 Supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Thermo Sci Hyclone | SV30010 | |
| Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium | eBiosciences | 00-4555-56 | |
| T25 flasks-vent cap green | SARSTEDT | 83.1810.502 | |
| 70% alcohol | JAX LAHS | ||
| 10% povidone-iodine topical solution | JAX LAHS | ||
| Ketamine HCl | Butler Animal Health Supply | NDC# 11695-0550-1 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | NADA# 139-236 | |
| Carprofen | JAX LAHS | ||
| Ophthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 0.5% Lidocaine HCl | REGENT, Inc. | NDC 0517-0625-25 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel Corp. | 46551 | |
| Sterile Swabs | Fisher Scientific | 23-400-114 | |
| Diamond paste | Widget Supply | BBE60 | |
| Tin oxide | LORTONE, Inc. | 591-038 | |
| Liner Bond 2V | KURARAY Medical Inc. | 1921-KA | |
| Clearfil AP-X | KURARAY Medical Inc. | 1721-KA | |
| Saline | JAX LAHS | ||
| Cover glass | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Hex Nut | Small Parts, Inc. | HNX-0090-C | |
| Syringe Pump | Syringepump.com | NE-1000 | |
| Two-Photon imaging system | Custom built (Any commercial system would work) |
Riferimenti
- Paulino, A. C., Teh, B. S. Treatment of brain tumors. N. Engl. J. Med. 352, 2350-2353 (2005).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N. Engl. J. Med. 352, 987-996 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Cheng, L., Bao, S., Rich, J. N. Potential therapeutic implications of cancer stem cells in glioblastoma. Biochem. Pharmacol. 80, 654-665 (2010).
- Cheng, L., Ramesh, A. V., Flesken-Nikitin, A., Choi, J., Nikitin, A. Y. Mouse models for cancer stem cell research. Toxicol. Pathol. 38, 62-71 (2010).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: the cancer stem cell hypothesis writ large. Mol. Oncol. 4, 420-430 (2010).
- Ebben, J. D., et al. The cancer stem cell paradigm: a new understanding of tumor development and treatment. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 621-632 (2010).
- Germano, I., Swiss, V., Casaccia, P. Primary brain tumors, neural stem cell, and brain tumor cancer cells: where is the link. Neuropharmacology. 58, 903-910 (2010).
- Park, D. M., Rich, J. N. Biology of glioma cancer stem cells. Mol. Cells. 28, 7-12 (2009).
- Bao, S., et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 66, 7843-7848 (2006).
- Calabrese, C., et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 11, 69-82 (2007).
- Barami, K. Relationship of neural stem cells with their vascular niche: implications in the malignant progression of gliomas. J. Clin. Neurosci. 15, 1193-1197 (2008).
- Gilbertson, R. J., Rich, J. N. Making a tumour’s bed: glioblastoma stem cells and the vascular niche. Nat. Rev. Cancer. 7, 733-736 (2007).
- Cho, R. W., Clarke, M. F. Recent advances in cancer stem cells. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 48-53 (2008).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat. Methods. 7, 981-984 (2010).
