बिजली नि: शुल्क, अनुक्रमिक न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन अलगाव
Summary
एक उपकरण और chemistries के क्रमिक रूप से अलग न्यूक्लिक एसिड बिजली के लिए की आवश्यकता के बिना एक नमूना से प्रोटीन द्वारा पीछा करने के लिए वर्णित हैं. एक हस्तांतरण विंदुक के भीतर आयोजित जबकि अलगाव chemistries और ठोस चरण निष्कर्षण सिद्धांतों पर आधारित हैं sorbent उपकरण होते हैं. अलग अणुओं इम्युनो आधारित और पीसीआर आधारित assays द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है.
Abstract
Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC’s proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient’s outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.
Protocol
Representative Results
Discussion
उपकरण chemistries, और इस रिपोर्ट में वर्णित प्रोटोकॉल बिजली मुक्त, बहु – macromolecule निकासी प्रणाली है कि क्षेत्र आधारित, बिंदु का देखभाल अनुप्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है की पहली ज्ञात उदाहरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. दोनों macromolecule प्रकार के नीचे की ओर निदान या विश्लेषणात्मक उपकरणों की एक संख्या के लिए लागू किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, अलग nucleic एसिड पीसीआर (चित्रा 2 और 3) गुणवत्ता के हैं जबकि नमूना प्रोटीन घटक immunoreactive है (चित्रा 4). दुनिया की तपस्या या संसाधन सीमित क्षेत्रों में इस निकासी व्यवस्था का उपयोग तेजी से वहां रहने वाले आबादी पर रोग के बोझ को कम कर सकता है. यह निकासी व्यवस्था भी तपस्या या दूरदराज के स्थानों में नमूना प्रसंस्करण के लिए एक मजबूत अभी तक तेजी से और लागत प्रभावी तरीका उपलब्ध कराने के द्वारा दुनिया भर में रोग निगरानी कार्यक्रमों में सहायता कर सकते हैं.
निष्कर्षण विधि के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू के ऊपर उल्लिखित है कियह उपयोगकर्ता के द्वारा संशोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, मामलों में जहां नमूना आकार अधिक से अधिक है या प्रारंभिक 500 μLs के (1.2 कदम) से भी कम है, उपयोगकर्ता तदनुसार अभिकर्मकों की मात्रा को समायोजित कर सकते हैं. यही कारण है, अभिकर्मकों का बड़ा नमूना आकार के अनुपात स्थिर रहते हुए पूर्ण संस्करणों बदला जा सकता है. इसके अलावा, sorbent अधिक मार्ग की संख्या में समायोजन को भी उपयोगकर्ता के विवेक पर किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, अगर एक बड़ा नमूना मात्रा में प्रयोग किया जाता है, sorbent अधिक बार की तुलना में सूचीबद्ध (चरणों 2.4 और 3.3) से अधिक नमूना गुजर macromolecule प्रकार (न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन) sorbent से संपर्क करने की संभावना में वृद्धि होगी. मार्ग में वृद्धि की दक्षता बढ़ाने पर कब्जा sorbent संतृप्ति तक पहुँच जाता है.
हमने पाया है कि निष्कर्षण उपकरण और संबद्ध chemistries के कुछ सीमाएँ हैं, जिनमें से सबसे महत्वपूर्ण है कि प्रोटीन निष्कर्षण रसायन विज्ञान के अत्यधिक ग्लाइकोसिलेटेड की वसूली के लिए अक्षम हैप्रोटीन. घटना में है कि नीचे की ओर नैदानिक लक्ष्य एक ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन से, इस प्रणाली की पहचान के लिए आदर्श नहीं हो सकता है. इसके अतिरिक्त, या तो nucleic एसिड या प्रोटीन के लिए निकासी क्षमता के ऊपरी और निचली सीमाओं को अभी भी निर्धारित किया जा रहा है, और अनुकूलन वसूली क्षमता को अधिकतम करने के लिए चल रहा है. उपकरण के आगे विकास के इन मौजूदा ज्ञान अंतराल को दूर करेंगे.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
निष्कर्षण विंदुक के विकास के लिए अनुदान के हिस्से में एक आंतरिक अनुसंधान और विकास अनुदान DRP के लिए सम्मानित किया गया द्वारा प्रदान की गई थी.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Guanidine Thiocyanate | Teknova | G4000 |
| ethanol | Pharmco-Aaper | 11ACS200 |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 109827-1L |
| BSA | Sigma | A-4503 |
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