Isolering av Cardiomyocyte kjerner fra Post-mortem Tissue

Summary

Cardiac atomkjerner er isolert via tetthet sedimentering og immunolabeled med antistoffer mot pericentriolar materiale 1 (PCM-1) for å identifisere og sortere cardiomyocyte atomkjerner av flowcytometri.

Abstract

Identifisering av cardiomyocyte kjerner har vært utfordrende i vevsdelene som de fleste strategier stole bare på cytoplasmatiske markør proteiner ^1. Sjeldne hendelser i hjerte myocytes som spredning og apoptose kreve en nøyaktig identifisering av hjertestans myocyte atomkjerner til å analysere mobilnettet fornyelse i homeostase og patologiske tilstander ^2. Her gir vi en metode for å isolere cardiomyocyte atomkjerner fra post mortem vev av tetthet sedimentering og immunolabeling med antistoffer mot pericentriolar materiale 1 (PCM-1) og påfølgende flowcytometri sortering. Denne strategien gir en høy gjennomstrømming analyse og isolasjon med fordelen av å arbeide like godt på fersk vev og frossen arkivmateriale. Dette gjør det mulig å studere materiale som allerede er innsamlet i biobanker. Denne teknikken er anvendelig og testet i et bredt spekter av arter og egnet for flere nedstrøms applikasjoner som karbon-14 ³ dating, celle-CYcle ⁴ analyse, visualisering av tymidin analoger (f.eks BrdU og IDU) ^4, transkriptom og epigenetic analyse.

Protocol

1. Isolasjon av Cardiac kjernene Coat Ultrasentrifuger rør (Beckman Sentrifugerør # 363664) med 10 ml 1% BSA / PBS belegg løsning. Cap rørene og la dem rotere i 30 min i en tube Rotator. Fjern belegget løsningen og la sentrifugerør luften tørr (en tube per mus hjerte kreves for analyse av enkle mus hjerter vekselsvis inntil 5 mus hjerter eller 1 g hjertet vev fra en annen art (f.eks menneske) kan behandles i en tube). Alle følgende trinn skal utføres på is. Dissekere venstre hjertekammer f…

Discussion

Nøyaktig identifisering av cardiomyocyte kjerner er avgjørende for analyse av regenerative prosesser i hjertemuskelen ^2,3. Konvensjonelle teknikker for å isolere cardiomyocytes fra frisk vev er hovedsakelig basert på enzymatisk nedbrytning av ekstracellulær matrix proteiner og den påfølgende rensing fra interstitielle celler ved lav hastighet sentrifugering. Ytterligere rensing av levende cardiomyocytes fra embryonale stamceller (ESC) kan utføres ved immunolabeling med overflate markører som Sirpa <s…

Materials

1. Lysis Buffer

Name of the reagent

0.32 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM CaCl2

5 mM magnesium acetate

2.0 mM EDTA

0.5 mM EGTA

1 mM DTT

2. Sucrose buffer

Name of the reagent

2.1 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM magnesium acetate

1 mM DTT

3. Nuclei storage buffer (NSB plus)

Name of the reagent

0.44 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)

70 mM KCl

10 mM MgCl2

1.5 mM spermine

Reagents and Equipment	Company
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415	Abcam
Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374	Atlas Antibodies
Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody	Life Technologies
DRAQ5	Biostatus
cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm	BD Biosciences
Glass douncer (40 ml) and pestle “L”	VWR (Wheaton Industries Inc.)
T-25 Ultra-Turrax Homogenizer	IKA Germany
Dispersing tool S25 N-18 G	IKA Germany
Beckman Avanti Centrifuge	Beckman Coulter
Falcon Tubes 15 ml and 50 ml	VWR
Beckman Centrifuge Tubes #363664	Beckman Coulter
JS13.1 free swinging rotor	Beckman Coulter
Influx cytometer	Beckman Coulter
Tube Rotator	VWR