Summary
Vi beskriver metoder för att fastställa
Abstract
Epitelial äggstockscancer (EOCs) är den vanligaste orsaken till död i gynekologisk malignitet i västerländska samhällen. Trots framsteg inom kirurgiska behandlingar och förbättrade platinabaserade kemoterapi, har det varit lite förbättring i EOC överlevnad för mer än fyra decennier 1,2. Samtidigt steg I tumörer har 5-årsöverlevnaden> 85%, överlevnad för steg III / IV sjukdom är <40%. Således kunde den höga dödligheten för EOC avsevärt minskas om tumörer upptäcktes vid tidigare, mer behandlingsbara, steg 3-5. För närvarande är den molekylära genetiska och biologiska grunden för tidigt sjukdomens utveckling dåligt förstådd. Mer specifikt är lite känt om den roll som mikromiljön vid tumörinitiering, men kända riskfaktorer för EOCs (t.ex. ålder och paritet) tyder på att mikromiljön spelar en nyckelroll i den tidiga uppkomsten av EOCs. Vi utvecklade därför tredimensionella heterotypiska modellerav både normal äggstock och tidigt stadium äggstockscancer. För den normala äggstocken, samarbetar vi odlade normala äggstockar yta epitelial (IOSE) och normal stromal fibroblast (INOF) celler, som förevigats av retrovrial transduktion av den katalytiska subenheten av humant telomeras holoenzym (hTERT) för att förlänga livslängden på dessa celler i kultur. Att modellera de tidigaste stadierna av äggstockarna epitelceller omvandling, överuttryck av CMYC onkogen i IOSE celler, återigen samodlas med INOF celler. Dessa heterotypiska modeller användes för att undersöka effekterna av åldrande och åldrande på omvandling och invasion av epitelceller. Här beskriver vi de metodologiska stegen i utvecklingen av dessa tredimensionella modell, dessa metoder är inte specifika för utvecklingen av normala äggstockar och äggstockscancer vävnad cancer, och kan användas för att studera andra vävnadstyper där stromala och epiteliala cell interaktioner är en grundläggande aspekt av vävnaden underhåll och di-sjukdomsbekämpning utveckling.
Protocol
Figur 1 illustrerar en översikt av arbetsflödet som beskrivs nedan.
1. Isolering av normala äggstockarna fibroblaster och förlängning av in vitro livslängd med Överuttryck av den katalytiska subenheten av hTERT holoenzym
- Ovarian vävnader kan samlas med informerad patient samtycke och godkännande av Institutional Review Board (för amerikanska institutioner). Normala äggstockarna vävnader kan samlas efter total abdominal hysterektomi eller total laparoskopisk hysterektomi med bilateral salpingooforektomi. I denna studie undersökta vävnaderna av en patolog och en del av äggstockarna stroman biopsier för cellodling. Vävnadsprover av ungefär 2-5 mm 2 skördades från det centrala området av äggstockarna att försöka minska risken för provtagning även äggstockarna epitel.
- Transport färsk äggstocksvävnad till cellkulturen laboratoriet i immortaliserade normal ovarial fibroblast (IOF) odlingsmedium, kompletterat med extra antibiotika och antimykotika. INOF tillväxtmedium (INOF-GM) innefattar: Medium 199 och MCDB105 blandades i ett förhållande 1:1, kompletterat med 15% fetalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 50 pg / ml gentamicin och 250 ng / ml amfotericin B.
- Arbeta i ett biosäkerhet skåp: Ta bort alla epitelceller som löst sitta kvar vävnaden, genom att tvätta provet med 5 ml PBS. Sug och upprepa två gånger.
- Överför provet plus PBS i en ren 10 cm i diameter (P100) kultur skålen. Använd steril pincett för att hantera vävnaden och placera den i en andra, torr P100 rent odlingsskål. Använd steril skalpell för att skära vävnad 0,5 cm 2 st. Placera varje bit vävnad i en separat P100 maträtt och ytterligare skuren i bitar <1 mm 2 i storlek. Tillsätt 20 ml INOF-GM (plus antibiotika och antimykotika), och inkubera vid 37 ° C, 5% COj 2. Övervaka celltillväxt med fasmikroskopi. Celler kan ses vidhäftar skålen wit hin 24 timmar.
- Re-foder efter en vecka och avlägsna eventuellt icke-vidhäftande vävnad genom aspiration. Därefter refeed kulturer två gånger i veckan. Celler bildar kolonier, vanligtvis inom 1-3 veckor. När dessa kolonier är stora nog att subkultur (när de når cirka 500 pm), isolera de kloner med trypsin-belagda kloning diskar.
Bekräfta celler är 100% fibroblastiska och fri från andra cellulära kontaminanter genom att stryka ett prov av cellinjen på täckglas och utföra immuno-fluorescerande färgning för en fibroblastisk markör (FSP), en epitelial markör (pan-cytokeratin) och en endotel cellmarkör (von Willenbrand faktor VIII). - Passage primär normal ovarial fibroblast (NOF) cellen isolat från en enda P100 maträtt i 3 P100 skålar en dag före retroviral transduktion av hTERT. Färdiga virala supernatanter kan köpas, eller produceras i egen regi med hjälp av standardprotokoll för samtransfektera HEK293T celler (setarget = "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/).
Retrovirala supernatanter kan framställas med användning av pBABE-hygro-vektorn hTERT (Addgene). Ta NOFS från inkubatorn och sedan aspirera cellodlingsmedium. Tillsätt 3 ml viral supematant till varje skål: en maträtt får hTERT-retrovirus, mottager 2: a skålen GFP-retrovirus och den tredje skålen får inget virus. Överlagra virala supernatanter med INOF-GM innehållande polybren för att ge en slutlig koncentration av 8 pg / ml. Re-feed celler följande dag med färskt medium. Två dagar efter infektion, börja val med låg dos (10 E / ml) hygromycin B. Efter sju dagar denna dos kan ökas till 20 U / ml, val bör vara avslutad inom 10-14 dagar. - Kloner uttryckande hTERT eller GFP kan isoleras genom kloning ring när de når omkring 500 um. Cellinjer kräver ytterligare karakterisering för att bekräfta framgångsrik expression av hTERT och bibehållande av primära funktioner cellinje. Detta innebär: (a)bekräfta telomerasaktivitet genom PCR-ELISA och telomerlängd, genom Southern blöt eller PCR 6,7, (b) bekräftar uttryck av kritiska markörer (t.ex. immunfärgning med en anti-pan-cytokeratin antikropp för att identifiera epitelceller, och med en anti- fibroblast ytprotein antikropp för fibroblaster) är jämförbar mellan primära och hTERT-immortaliserade celler, (c) bekräftar cellerna inte visar egenskaper hos neoplastisk transformation (t.ex. med förankringsoberoende tillväxt analyser), (d) bekräftar förlängning av in vitro livslängd observerats i . celler uttryckande hTERT men inte GFP hTERT-uttryckande immortaliserade normala äggstockarna fibroblaster (INOFs) bör kringgå replikativ senescens men inte vara neoplastiskt transformerade, dessutom de INOF cellerna bör bibehålla uttrycket av fibroblast ytprotein men inte epiteliala markörer såsom cytokeratin (fig 2) .
2. Beläggning av vävnad Culture Rätter med polyHEMA för icke-vidhäftande cellkultur
- För att bereda polyHEMA lösningen, väg upp 1,5 g polyHEMA och plats i en steril flaska. Lägg 95 ml molekylärbiologi grad absolut etanol och 5 ml cellkultur grad destillerat vatten. Den polyHEMA hydrogelen kommer att upplösas i vatten i lösningen och etanolen kommer sterilisera preparatet.
- Placera polyHEMA lösningen i ett vattenbad vid 65 ° C tills den är helt upplöst. Detta kan ta upp till 8 timmar. Observera att polyHEMA lösningen inte kan lagras under lång tid och bör alltid vara beredda färska.
Felsökning: Lösningar av polyHEMA kräver långa inkubationstider vid 65 ° C. Regelbundet invertera polyHEMA lösningen för att blanda. Viskositet observerades vid botten av glasflaska anger att polyHEMA inte är helt upplöst och ytterligare inkubation vid 65 ° C krävs. - Arbeta i en laminärt flöde huva, päls vävnadskultur rätter med polyHEMA lösningen. Varje size av vävnadsodlingsskål, kolv eller flerkällsplattan kan beläggas med polyHEMA. Rekommenderade volymer av polyHEMA lösning som krävs för varje fartyg anges i tabell 2.
- Låt cellodling rätter att torka inne i laminärt flöde huva. Det kan ta 2-3 dagar. Försiktig skakning på en gungande plattform kan användas för att säkerställa jämn beläggning av större storlek rätter eller kolvar. Om polyHEMA lösningen torkar för fort ytan kanske inte jämn. För att undvika detta, se till locket på skålen / kolven förblir på under hela torkningsprocessen.
- Applicera ett andra skikt av polyHEMA och låt torka enligt ovan.
Felsökning: Hål i polyHEMA beläggningen kan uppstå, särskilt när plattorna torkar för snabbt. Dubbel-beläggning av plattorna med polyHEMA hjälper att täcka luckor eller sprickor i beläggningen täcks före användning. Plattorna tar vanligtvis 2-3 dagar för varje polyHEMA päls att torka och så bör förberedas minst en vecka innan de kommer att behövas för cellodling. - PolyHEMA-belagda plattor kan förvaras vid rumstemperatur fram till användning.
OBS: 1% agaros-lösningar, löst i 1X PBS och autoklaverades för att sterilisera, kan också användas för att belägga kultur cell rätter att skapa en icke-vidhäftande yta för kortvarig odling 3D (mindre än en vecka). Agaros beläggning av flerbrunnsplattor skapar en konkav yta som främjar bildningen av en enda sfäroid per brunn för många cellinjer. Men längre 3D kulturer polyHEMA beläggning rekommenderas som agaros beläggning ofta sönderfaller efter längre kultur perioder.
3. Generera tredimensionell (3D) heterotypisk sfäroider och Re-utfodring av 3D kulturer
- Återhämta och bygga INOF och epitelial cellkulturer in vitro för att förbereda tillräckligt med celler för att etablera 3D heterotypiska sfäroider. För "massa kulturer" vi vanligtvis utsäde 2-4x10 6 INOFs per P100 skål och 0,5-1x10 6 epitelceller för att ge en stromal: epitelial raTio av 4:1. INOF celler odlas i INOF tillväxtmedium (INOF-GM) utan gentamicin eller amfotericin B. Om så önskas, kan fibroblastceller förbehandlas före 3D kultur (t.ex. för induktion av senescens, kan celler behandlas med subletala doser av väteperoxid ).
- Tvätta en torr polyHEMA platta med 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under 5 minuter. Aspirera PBS och ersätt med 15 ml INOF-GM.
- Samtidigt Trypsinisera immortaliserade normala ovariala fibroblastceller att lösgöra dem från odlingsskålen efter 3-5 min neutralisera trypsinet med en lika stor volym odlingsmedium och pelletera cellerna genom centrifugering vid 450 x g under 5 minuter.
- Kasta bort supernatanten. Skapa en enda cellsuspension genom att återsuspendera cellpelleten i 5 ml INOF-GM, blanda väl genom pipettering upp och ned eller vortexa varsamt. Bestäm cellkoncentrationen genom att blanda 10 pl cellsuspension och 10 il trypanblått och räkna med användning av en hemocytometer. Trypanblåttexklusion kan användad för att identifiera levande celler.
- Lägg 4x10 6 INOF celler till mediet redan fördelas i polyHEMA-belagda plattan. Fyll odlingsmediet volymen till 20 ml med användning av en lämplig volym av färsk INOF-GM och inkubera vid 37 ° C, 5% COj 2. Celler börjar aggregat i flercelliga sfäroider inom 24 timmar. Sfäroid-bildning kan övervakas genom fasmikroskopi.
Exakt räkning av sfäroid nummer i massa odlingsbetingelser är svårt, men vi bedömer att vi får 50-100 sfäroider när 4x10 6 stromaceller stryks. Sfäroid storlek varierar vanligtvis från 80 till 250 nm. - Re-foder sfäroid kulturerna var 2-3 dagar genom att vila plattorna i en vinkel på en pipett placeras inom laminärt flöde huva. Låt sfäroiderna att lösa. Detta kan ta upp till 20 minuter. Ta försiktigt bort utmattade media med en 5 ml pipett, tills endast ca 4 ml kvar i skålen. Se till att inte aspirera sfäroiderna. Re-foder med 16 ml färsk INOF-GM och återgå till inkubatorn.
- På dag 7, lägg epitelceller till fibroblast sfäroider för att skapa heterotypiska kulturer enligt följande. Förbered suspensioner av äggstockarna epitelceller (fenotypiskt normala eller transformerade) genom trypsinisering som beskrivs i avsnitt 3,4-3,5. Bestäm cellkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer. Tvätta en gång i INOF-GM för att förhindra tillväxtfaktorer från förs över från de epiteliala tillväxtmedier.
I vårt laboratorium, epitelceller (OSEC) linjer normala äggstockscancer yta samlades med informerat patientens medgivande från äggstockarna avlägsnats genom total abdominal hysterektomi eller total laparoskopisk hysterektomi med bilateral salpingooforektomi. Äggstockar var borstas med en steril cytobrush att samla epitelet. Primära cellinjer etablerades och transducerades med hTERT användning av den metod som beskrivs ovan. Uppgifter om OSEC kultur i 2D, kan 3D och OSEC immortalisering hittas i referenser 10 och 11. - För att bilda heterotypisk SPHeroids, första re-feed kulturer av fibroblast sfäroiderna ensam. Sedan ympa fibroblast sfäroid kulturer med 1x10 6 epitelceller vid ett förhållande av 4:1 fibroblaster till epitelceller. Kultur heterotypiska sfäroiderna i INOF-GM.
- Re-foder heterotypiska kulturer var 2-3 dagar för ytterligare 14 dagar.
4. Behandling för Imaging and Molecular analyser
- Många olika tekniker kan användas för att analysera de heterotypiska sfäroider. För avbildning, rekommenderas att sfäroider skördas från odlingsskålen med en 25 ml pipett. Pipettering sakta kommer att minimera risken för skjuvkrafter som stör arkitektur sfäroid. Sfäroider kan sedan tvättas i PBS och pelleterades genom försiktig centrifugering vid 100 xg under 10 minuter, högre centrifugalkrafter kan skada sfäroiderna. Alternativt, kan kulturerna överföras till en 50 ml Falcon-rör och fick sedimentera, och odlingsmediet avlägsnades sedan.
- För immunohistokemi, fastställa sfäroider med neutral buffrad formalin under 30 minuter vid rumstemperatur. Pellet sfäroiderna och ersätta formalin med 70% etanol. Processen i paraffin med användning av standardprotokoll som används för mänskliga vävnader. Paraffininbäddade sfäroiderna kan vara sektioneras och färgas med antingen hematoxylin och eosin eller specifika molekylära markörer med vanlig immunohistokemi (Figur 3).
- Alternativt kan sfäroiderna tvättas i PBS fastställas i 4% paraformaldehyd (beredd i PBS), inbäddad i Optimal Cutting Temperature oktober medium och snabbfrystes för fryst snittning och immunfluorescensfärgning.
- För molekylära analyser, kan sfäroiderna skördas, pelleterades och tvättades två gånger i PBS innan lysera celler för DNA, RNA eller protein extraktion.
- För analys genom flödescytometri, kan sfäroiderna tvättas i PBS och dissocierades genom trypsin eller Accutase digerering vid 37 ° C. För att göra detta, doppa Falcon röret med sfäroider iNa vattenbad för att underlätta trypsinisering. Fullständig dissociation av sfäroider i en enkelcellsuspension kan främjas genom att pipettera lösningen upp och ned med en 1 ml pipettspets. Se till att inte över-Trypsinisera cellerna.
Neutralisera reaktionsblandningen med en lika stor volym av odlingsmedium och avlägsna cellklumpar genom att passera suspensionen genom en 40-70 pm cellfilter. Pelletera celler, tvätta med PBS, räkna och återsuspendera det önskade antalet celler i FACS-buffert. Stain celler enligt tillverkarens instruktioner.
5. Representativa resultat
Detta tillvägagångssätt kan användas för ett brett spektrum av tillämpningar, och för studier av normala äggstockarna biologi samt studier av äggstockscancer initiering. En stor fördel med detta tillvägagångssätt över 3D kulturer skapats med användning av kommersiellt tillgängliga extracellulär matrix gel är att de normala fibroblasterna äggstockarna producerar den extracellulära matrisen som gör up kärnan i sfäroiderna. I vår erfarenhet, är matrisen som producerats av normala äggstockarna fibroblaster heterogen och mer liknar den extracellulära matrisen i äggstockarna än någon kommersiellt tillgänglig matrisgel. I vårt laboratorium har vi utnyttjat epitelceller som har delvis omvandlats in vitro med definierade genetiska element (t.ex. CMYC överuttryck) och co-odlade dessa celler med normala och åldrande äggstockarna fibroblaster för att efterlikna tidigt stadium äggstockscancer i en postmenopausal äggstocken. Våra data antyder att den åldrande mikromiljön främjar neoplastiska egenskaper (t.ex. proliferation) av partiellt transformerade epitelceller (figur 3), medan en normal mikromiljö inhiberar neoplastisk utveckling 8. Vårt labb och andra har också använt liknande metoder för att modellera normala äggstockarna epitelceller 9, äggledaren epitelceller, stegvisa modeller av neoplastisk utveckling
Figur 1. Schematisk översikt av protokollet för 3D heterotypisk odling. Vävnadsodlingskolvar är dubbelt belagda med ett 1% polyHEMA lösning och får torka. PolyHEMA belagda plaster tvättas med 1 x PBS omedelbart före användning. Odödliggjorda normala äggstockarna fibroblastceller (4x10 6 celler) stryks ut i kolven med 20 ml tillväxtmedium. Sfäroid-bildning och tillväxt övervakades under 7 dagar. Vid denna punkt, är fibroblast sfäroid kulturer ympade med 1x10 6 epitelceller, och de två celltyper samodlas i 14 dagar innan de flercelliga sfäroider skördas och bearbetas för nedströms tillämpningar (molekylära analyser, bildbehandling, etc).
Figur 2. Immunofluorescensfärgning av hTERT </ Em> immortaliserade normala äggstockarna fibroblaster. Både primär normala äggstockarna fibroblaster (Pr NOFS) och immortaliserade normala äggstockarna fibroblaster (INOFs) uttrycker fibroblast specifikt protein (FSP), inte uttrycker cytokeratin-7 (Ck-7) och express vimentin (VIM) . Markörer av intresse visas i grönt, är DNA färgas med DAPI och visas i blått, är cytoplasma motfärgades med Evans blå och visas i rött.
Figur 3. Immunohistokemi av sam-odlade stromala och epitelceller. Vänster panel, normal ovarial fibroblast sfäroid monokultur, färgas av hematoxylin och eosin. Normala äggstockarna fibroblastceller odlades ensam i 3D-form sfäroider bestående av celler med en spindled-morfologi och riklig extracellulär matrix. Höger panel: normal äggstockarna fibroblaster exponerades för väteperoxid för att inducera åldrande. Delvis transformerade äggstockarna epitelceller (IOSE
Figur 4. Histologiska funktioner i 3D odlade celler reflekterar primära vävnader. (A) klarcellig äggstockskarcinom visar karakteristiska klara cellstrukturer, dessa är frånvarande när klarcellig EOC linjer odlas på plast men liknande strukturer upptäcks när samma celler odlas som 3D sfäroider ( B). (C) svepelektronmikrofotografi av normala äggstockarna epitelceller odlas som sfäroider för 14 dagar. Surface mikrovilli är synliga (pilar). (D) serös äggstockscancer cellinje sfäroider, i kultur. (A, B) hematoxylin och eosin-färgning av sektionerad paraffininbäddade tumörvävnad eller 3D sfäroider, (C) svepelektronmikroskopi, (D) faskontrastmikroskopi. Sfäroider kan vara sfärisk (streckad cirkel)eller oregelbundna till formen, såsom i fallet av strukturen ses i den vänstra sidan av bilden.
| Fat / tavla storlek | Volym av polyHEMA (skall tillämpas två gånger) | Kultur Media Final Volume |
| 6-brunnars platta | 3 ml | 5-7 ml |
| 12-brunnars platta | 1,5 ml | 2 ml |
| 24-brunnars platta | 500 pl | 1,5 ml |
| 48-brunnars platta | 250 pl | 500 pl |
| 96-brunnars platta | 50 il | 200 pl |
| P100 odlingsskål | 4-5 ml | 20 ml |
| P60 odlingsskål | 2-3 ml | 5-7 ml |
| F25 kolv | 2-3 ml | 7 ml |
| F75 kolv | 4-5 ml | 20-30 ml |
| F175 kolv | 15 ml | 30-50 ml |
Tabell 2. Rekommenderad volymer för polyHEMA beläggning och 3D odling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biologi tidig epitelial äggstockscancer (EOC) är dåligt känd. Kanske en av de största hindren på detta område under många år har varit bristen på förståelse för vävnadsspecifika ursprung sjukdomen, och av betydelsen av den roll som mikromiljön i EOC utveckling. Under de senaste åren har har blivit tydligt att EOC är en heterogen sjukdom med flera olika histophathological subtyper, förmodligen med olika cellulära ursprung för olika subtyper. Till exempel de aktuella data tyder på att hög kvalitet serösa EOCs kan härröra från såväl fallopian epitelceller rör sekretoriska celler och äggstockarna yta epitelceller, åtminstone en del av endometrioid och tydliga cell EOCs tros uppstå från äggstockarna endometrios (endometrioma), och mucinous EOCs kan uppstå från paraovarian eller paratubal övergångsperiod typ epitel 15,16. Emellertid har det varit endast begränsad in vitro och <em> in vivo modeller av sjukdomsprogression för någon av dessa histotypes. in vitro heterotypisk modellering av EOC att studera tumörstroma-epiteliala interaktioner och mikromiljön förknippade med att utveckla äggstockskarcinom är en ännu mindre utvecklad forskningsområde. Den tumörstroma är sannolikt både en källa till tumör biomarkörer samt ett nytt mål för terapi. Utveckling och användning av heterotypiska modeller av EOC kan därför vara nyckeln till att identifiera nya biomarkörer associerade med tidig skede av sjukdomen, som kan användas som en del av ett program för screening och tidig sjukdom upptäckt, eller för att identifiera nya, till druggable terapeutiska mål att förbättra behandlingsregimer för patienter med diagnosen EOC.
Mer fundamentalt, kunde de modeller vi har beskrivit kan användas för att få en djupare förståelse av de underliggande fenotypiska och molekylära förändringar som sker under EOC initiering och tidig sjukdomsutveckling. Det är nu klart att olika EOC subtyper har olika molekylära profiler, kliniska egenskaper och underliggande biologi. Genom att generera ett bibliotek av EOC prekursorceller och modellering utveckling av varje cancer subtyp, inklusive microenvironmental influenser, kan det vara möjligt att få nya insikter i utvecklingen av EOC histotypes genom modeller som korrekt återspeglar sjukdomens utveckling i människans villkor. De metoder som vi beskriver kan tillämpas på ett brett spektrum av studier och tillämpningar, innefattande studier av andra fasta tumörer. Vi har testat sfäroid bildning förmåga i över 50 olika normala och transformerade linjer äggstockarna cellinjer hittills, och konstaterade att de allra flesta cellinjer kan bilda sfäroider när utströks vid höga celldensiteter på polyHEMA-belagda plattor. Vi räknar därför med att modeller cellodling från andra däggdjur organ och även andra arter kan också odlas i 3D med denna metod.
ve_content "> Dessa metoder kan utgöra ett förskott speciellt för att studera den roll som mikromiljön vid tumörinitiering, till exempel i studier av samspelet mellan diskreta somatiska genetiska avvikelser i tumör epitelceller som finns samtidigt med specifika microenvironmental variabler. Vi har visat att fenotypiska förändringar i stromaceller kan påverka epitelceller fenotyp 8. Genom att ändra de celltyper som ingår i modellen, kan man undersöka huruvida olika stromaceller differentiellt påverkar epitelcellproliferation och även uttryck av andra specifika markörer, t.ex. markörer associerade med invasion eller metastas. Dessutom är dessa modeller kan även användas i studien av godartad sjukdom och normal ovarial fysiologi. Exempelvis kan sådana 3D-modeller användas fertilitetsstudier att utvärdera den roll som äggstockarna stroma under oocytmognad.För att studera bidraget från microenvironment till EOC utveckling och betydelsen av äggstockscancer-associerade fibroblaster i maligna EOCs kan dessa modeller också anpassas genom samtidig odling av celler äggstockscancer med fibroblaster isolerade från tumörprover. Mer komplexa kulturer kan också genereras genom att införa ytterligare, relevanta celltyper i heterotypisk strukturen. Exempelvis kan modellen av stromala och epiteliala cellinteraktioner vi utvecklat kompletterades med med införandet av granulosa celler, immun-eller endotelceller. En annan möjlighet vore att samarbeta kultur andra prekursorcell i äggstockarna stroma-modellen, som epitelceller från äggledaren och livmoderslemhinnan. Det är också möjligt att modellera ytterligare parakrina interaktioner som föreslås vara viktigt under EOC initiering. Till exempel, kan steroidhormoner införas i heterotypisk modellen, eller uttryck av parakrina verkande gener kunde störas uteslutande i den stromala avdelningen ocheffekten på epitelceller mättes.
Majoriteten av äggstockscancer identifieras i ett sent skede, efter att sjukdomen har bred spridning i hela bukhinnan. Äggstockscancer diagnostiseras när lokaliserad till äggstockarna (etapp 1) kan effektivt behandlas med kirurgi och i över 90% av fallen patienterna botade från sin sjukdom. Det är uppenbart att strategier för tidigare upptäckt av äggstockscancer avsevärt skulle kunna minska sjukligheten äggstockscancer och dödlighet. Genom att få en djupare förståelse för tidigt skede av sjukdomen utveckling med organotypic modellering metoder som de som beskrivs här, är det planerat att nya möjligheter till sjukdom upptäckt i riskgrupper kommer att avslöjas och slutligen översättas till klinisk praxis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna forskning utfördes vid Keck School of Medicine, University of California, USA, och University College London, Storbritannien. KL finansieras av National Institute of Health bidrag 5 U19 CA148112-02. BG har finansierats av ett projekt bidrag från Eva Appeal gynekologisk onkologi välgörenhet (Storbritannien). En del av detta arbete bedrivs på UCLH / UCL delvis finansiering från Department of Health: s NIHR biomedicinsk forskning Centre stödordning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 | |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 | |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 | |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 | |
| PBS | VWR | 12001-766 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| Cell strainer (40 or 70μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
|
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 | |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 | |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 | |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study. |
|||
References
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J. Clin. , (2011).
- Office for National Statistics. Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008. , England. (2011).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications. Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies. PLoS Med. 5, e232 (2008).
- Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier. Cancer. 104, 1398-1407 (2005).
- Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR. Nucleic Acids Res. 39, e134 (2011).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP. Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12, 317-325 (2010).
- Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells. Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).
- Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers. Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).
- Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer. Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).
- Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC. Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers. Neoplasia. 12, 579-589 (2010).
- Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
- Kurman, R. J., Shih, I. eM. Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer--shifting the paradigm. Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).
