Analyse cellulaire spécifique de<em> Arabidopsis</em> Feuilles en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé

Summary

Procédé de fabrication d'<em> Arabidopsis</em> Protoplastes de feuilles qui sont compatibles avec le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), ce qui permet l'étude des populations cellulaires spécifiques. Cette méthode est compatible avec n'importe quel<em> Arabidopsis</em> Line qui exprime la GFP dans un sous-ensemble de cellules.

Abstract

Après le début de l'ébauche de feuille, l'accumulation de la biomasse est commandé principalement par la prolifération des cellules et de l'expansion dans les feuilles ^1. Toutefois, la feuille d'Arabidopsis est un organe complexe composé de plusieurs types cellulaires différents et plusieurs structures. Dans le même temps, la feuille de plus en plus contient des cellules à différents stades de développement, les cellules les plus éloignées du pétiole Soyez le premier à arrêter l'expansion et se soumettre à la sénescence ^1. Les différentes cellules dans la feuille sont donc diviser, élongation ou de différenciation; actif, stressés ou morts, et / ou répondre à des stimuli dans les sous-ensembles de leur type cellulaire à un moment donné. Cela rend l'étude génomique de la contestation feuille: par exemple lors de l'analyse des données d'expression de feuilles entières, des signaux de réseaux génétiques qui opèrent dans des zones distinctes de réponse cellulaire ou des types cellulaires seront confondus, résultant en un profil inexactes généré.

Pour résoudre ce problème, slusieurs méthodes ont été décrites qui permettent les études d'expression génique de cellules spécifiques. Il s'agit notamment de capture microdissection laser (LCM) ² ou les plantes exprimant la GFP utilisées pour la production de protoplastes et après le tri cellulaire par fluorescence (FACS) ^3,4, le système a récemment décrit l'état intact de précipitation nucléaire ⁵ et ⁶ immunoprécipitation de polysomes.

FACS a été utilisé avec succès pour un certain nombre d'études, notamment en montrant que l'identité de la cellule et la distance de l'extrémité de la racine a eu un effet significatif sur les profils d'expression d'un grand nombre de gènes ^3,7. FACS de lignes GFP ont également été utilisées pour démontrer spécifique des cellules régulation transcriptionnelle lors des interventions d'azote racines et le développement des racines latérales ^{8, 9} Répartition sel de stress auxine dans la racine ¹⁰ et de créer une carte d'expression génique du méristème apical Arabidopsis ^11. Bien queFACS a déjà été utilisée pour trier les protoplastes de feuilles d'Arabidopsis dérivés fondés sur autofluorescence ^12,13, jusqu'à l'utilisation de FACS sur des lignes d'Arabidopsis exprimant la GFP dans les feuilles a été très limitée ^4. Dans le protocole suivant, nous décrivons une méthode pour obtenir des protoplastes de feuilles d'Arabidopsis qui sont compatibles avec FACS, tout en minimisant l'impact du régime de production de protoplastes. Nous démontrons la méthode utilisant la ligne KC464 Arabidopsis, qui expriment la GFP dans l'épiderme ventral ^14, la ligne KC274, qui expriment la GFP dans le tissu vasculaire ¹⁴ et la ligne Arabidopsis TP382, qui expriment la GFP construction en double lié à un signal de localisation nucléaire les cellules de garde (données non présentées, figure 2). Nous sommes en train d'utiliser cette méthode pour étudier à la fois l'expression spécifique au type cellulaire au cours du développement et le stress, ainsi que des populations de cellules hétérogènes à différents stades de la sénescence.

Protocol

1. Génération de protoplastes Matériel foliaire Récolte et les couper en lanières 1 mm de large (figure 1) avec une lame de rasoir. Pour les échantillons contenant plus d'une seule feuille jusqu'à 15 feuilles peuvent être facilement empilés avant de couper. Transférer immédiatement les bandes de feuilles dans une boîte de Petri de 9 cm rond contenant 20 ml de solution A (400 mM de mannitol, 20 mM de MES hydrate, 20 mM KCl, CaCl2 10 mM, MgCl2 2 mM, BSA 0,1% et 2,5 mM de β-mercaptoéthanol, pH 5,7) y compris les enzymes protoplastes (1,2% de cellulose R-10, la cellulose 0,6% et 0,4% RS macerozyme R-10) et de RNase et d'inhibiteurs de la transcription (1 × ProtectRNA et 10 pg / ml d'actinomycine D); séparer délicatement les feuilles et bandes aspirateur infiltrer pour 2 x 5 min. Lieu boîte de Pétri sur un agitateur orbital réglé à 90 tours par minute à la température ambiante et de protoplastes pour 3-4 heures. Au cours de l'incubation, les bandes de feuille doivent être séparés les uns des autres, par utilisation d'unjeu de pinces plates, les demi-heures. Placez un 70 um tamis cellulaire (Fisher Scientific) dans un tube de 50 ml et doucement filtrer la solution à travers protoplastes. Cela permettra d'éliminer les bandes de feuilles, qui seront retenues par le tamis tout en permettant aux protoplastes à passer. Laver les barrettes de feuilles avec 4 ml de solution A et doucement à travers le tamis de filtre même. Transférez les protoplastes dans des tubes à fond rond et centrifuger la solution de protoplastes à 300 xg pendant 5 min à pellets les protoplastes. Aspirer le maximum de surnageant sans déranger les protoplastes. Laver les protoplastes avec 5 ml de solution A et centrifuger à 300 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant Remettre en suspension les protoplastes dans un volume approprié de la solution A, à l'aide d'une pipette Pasteur ou une pointe P1000 coupure. 2. FACS de protoplastes foliaires </p> Immédiatement avant le triage, remettre en suspension les protoplastes en utilisant une liste (non coupé) P1000 pointe pour éviter les protoplastes s'agglomérer. Transférer des protoplastes à un tube de tri à travers un filtre 50 um Filcon (BD Biosciences) et le cas échéant diluer pour éviter le colmatage de la buse de la trieuse de cellules. Les protoplastes sont triés à l'aide d'une buse de 100 um à une pression de 20 psi (gaine) et de 21 à 21,5 psi (échantillon), une fréquence de 39,2 kHz et un taux d'événements de <4000 (ces paramètres sont optimales sur un trieur de cellules bd afflux (bd biosciences). optimisation d'autres machines tri devrez peut-être ajuster ces paramètres). protoplastes gfp positives identifiées à l'aide d'un laser argon 488 nm et le tracé la sortie du passe-bande 580 30 filtre (orange) par rapport au 53040 (vert). gfp-positives sera dans grande low population, avecles non-gfp bas faible population morts qui meurent > Figure 2. Les lignes KC464, KC274 et TP382 utilisées dans cette étude. A) Coupe transversale d'une feuille KC464 montrant l'expression de la GFP dans l'épiderme ventral. B) Les protoplastes provenant de feuilles KC464. C) Coupe transversale d'une feuille KC274 montrant l'expression de la GFP dans le système vasculaire. D) Les protoplastes issus de KC274 feuilles. E) feuille TP382 montrant l'expression de la GFP dans les cellules de garde. F) provenant de protoplastes TP382 feuilles. G) Exemple de l'enrichissement obtenu par FACS de la GFP exprimant des cellules de garde à l'arrière-plan complexe de cellules de la feuille, montrant GFP contenant des protoplastes de la 530/low 580 de population de protoplastes issus de TP382 feuilles. AF: les images microscope confocal; G: image Microscope à fluorescence. Barres d'échelle dans les images sont de 50 um. Figure 3. Typiques parcelles FACS points d'acquisition de la sortie de la 580/30 nm (orange) vs 530/40 nm (vert) filtres passe-bande (trieur de cellules BD Influx). Les portes de tri indiquées sont celles généralement utilisées pendant le tri. A) en points de protoplastes Col-4 feuilles dérivés, protoplasted en l'absence d'inhibiteurs, montrant une seule 530/low bas 580 habitants. B) en points de poids Col-4 feuilles de protoplastes dérivés, protoplasted en présence d'inhibiteurs, montrant un changement de la fluorescence 580 à cause du stress et la coloration par les inhibiteurs. CE) Dot parcelles de feuilles protoplastes dérivés à partir des lignes KC74, KC464 et TP382, respectivement, protoplasted en présence d'inhibiteurs de la GFP, montrant contenant populations dans le haut 530/low 580 populations. Les pourcentages des événements dans les GFP (haute 530/low 580) les populations sont donnés. Cliquez ici pour agrandir la figure . e_content "fo: keep-together.within pages =" always "> Figure 4. Expression de la GFP dans les fractions représentatives de la population dépendants comme le montre la figure 3. Deux biologique reproduit ont été obtenus pour chaque type de fraction, amplifié en utilisant le système Ovation Pico WTA et qPCR utilisant des amorces spécifiques de la GFP (tableau 2) a été effectuée. Les valeurs indiquées sont les plus élevées (rouge), le plus bas (vert) et la moyenne des valeurs relatives. La population était élevée 580 dans ce cas divisée en deux, une faible 530/low 580 et haute 530/low 580, dont une réplique biologique unique a été utilisé afin que la seule valeur est indiquée. ACT2 (At3g18780) a été utilisé comme un standard pour tous les échantillons. Feuille: Feuilles entières. Unsorted: protoplastes non triés. GFP1: haute 530/low 580 et REST1: faible 530/low 580, GFP2: 530/high haute 580 et REST2: faible 530/high 580, tel que décrit à la figure 3 et l'insert. Les résultats sont un o vérificationf évaluations optiques du contenu de la cellule GFP dans les fractions triées (2G figure, par exemple). Cliquez ici pour agrandir la figure . Échantillon Nombre de feuilles Nombre de cellules ARN rendement (Ng) ARN rendement (Amplifié; ng) Une feuille entière B Feuilles entières 1 1 – – 8001 10525 4623 *** 4572 *** Un protoplastes Unsorted Unsorted B protoplastes 5 5 – – 2433 2625 1152 *** 3321 *** Un GFP1 Un REST1 15 6039 (0.39% *) 55389 (6.40% *) – ** – ** 861 489 GFP1 B REST1 B 15 10.783 (0.63% *) 57 040 (7,49% *) – ** – ** 537 420 GFP2 Rest2 15 18337 (1.49% *) 62 405 (73,49% *) – ** – ** 360 411 Les échantillons Tableau 1. Recueillies à l'aide FACS et analysées par qPCR afin de déterminer quelle fraction contenait vivantes exprimant GFP-protoplastes. Sont également inclus dans ce tableau est le rendement d'ARN total en ng avant et après amplification avec le système Ovation Pico WTA (NuGen). Fractions GFP1, GFP2, REST1 REST2 et sont indiquées dans l'insert de la figure 4. * Le pourcentage de cellules de la course de tri cellulaire total est donné entre parenthèses à côté du nombre de cellules dans la fraction. Ces pourcentages ne sont pas corrélées àl'autre pour chaque échantillon, le type FACS fonctionne pour les fractions «repos» ont été arrêtés plus tôt que pour les fractions GFP en raison du nombre beaucoup plus élevé de cellules de repos collectées. ** 50 ng utilisé comme entrée pour les réactions d'amplification, selon le protocole du fabricant. Apprêt Séquence mGFP5-ER.fw GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA mGFP5-ER.rv TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT ACT2.fw GCCATCCAAGCTGTTCTCTC ACT2.rv GCCATCCAAGCTGTTCTCTC Tableau 2. Amorces qPCR.

Discussion

Nous avons décrit une méthode qui permet l'utilisation de plantes d'Arabidopsis exprimant la GFP dans les feuilles pour la production de protoplastes et tri cellulaire ultérieure à l'aide FACS. Cette méthode donne des quantités suffisantes d'ARN à être utilisées pour l'amplification et l'analyse subséquente par conséquent supporte qPCR ou puce à ADN. Les fractions triées sont hautement enrichi pour la GFP contenant des cellules, tel que démontré par qPCR (Figure 2).

Pour obtenir des rendements élevés de protoplastes vivants, il est essentiel de travailler rapidement au cours des premières étapes de la procédure, jusqu'à ce que les bandes de feuilles ont été infiltrées sous vide avec la solution de protoplastes contenant l'inhibiteur. En outre, lors de la génération bandes de 1 mm feuilles, il est très important de trancher ou couper les feuilles plutôt que «chop» ou écrasez-les, car cela conduit à des dommages excessifs et donc un rendement inférieur de protoplastes.

Une différence cruciale entre la méthode décrite ici et publishe autreméthodes d est l'utilisation d'inhibiteurs de RNase et d'inhibiteurs de la transcription. La plupart des méthodes sont développées pour les racines d'Arabidopsis, dont protoplastes peuvent être générées plus facilement. Toutefois, lorsque vous travaillez avec des feuilles, à l'exception du mésophylle, il est nécessaire d'augmenter le temps de génération de protoplastes. Par conséquent, il est important d'inclure ces inhibiteurs pour protéger contre les variations de l'expression des gènes à la suite du traitement génération de protoplastes lui-même (données non présentées). Cependant, la présence des inhibiteurs conduit à une incapacité à monter une réponse transcription, soit par commutation des gènes ON ou OFF, ce qui est susceptible de rendre les protoplastes plus vulnérables car cela conduit à une perte de plasticité permet de contrer le stress de la protoplastes procédure.

Nous avons utilisé la méthode décrite ici avec succès un certain nombre de lignes exprimant la GFP Arabidopsis. Surtout, nous avons utilisé cette méthode avec des lignes GFP exprimant la GFP soit fortementle noyau, ou beaucoup plus faiblement de manière non-localized/diffuse cytosolique, comme c'est le cas avec les KC464 KC274 et lignes utilisées ici. Les deux types de lignes sont compatibles avec la méthode et le rendement des fractions hautement enrichi de GFP exprimant protoplastes (Figure 2 et 3). La méthode pourrait être facilement adaptée à d'autres fluorophores, bien que le fluorophore doit être sélectionné pour que la fluorescence est significativement différente de l'autofluorescence des cellules mortes / meurt afin de préserver la possibilité de sélectionner les cellules vivantes.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Cellulase R-10	Melford	C8001
Cellulase RS	Melford	C8003
Macerozyme R-10	Melford	M8002
BSA	Sigma-Aldrich	A3912
ProtectRNA	Sigma-Aldrich	R7397
Actinomycin D	Sigma-Aldrich	A1410
70 μm cell strainer	Fisher	FB35181
50 μm filcon cup-type filters	BD Biosciences	340630