גישה ניתוחית חדשנית למנהל Intratracheal של סוכני יו במודל של עכברים עוברי
Summary
פתחנו גישה ניתוחית חדשנית לממשל intratracheal של סוכני יו לעובר העכבר. מסלול המשלוח הוא יעיל יותר במיקוד ריאות העכבר העובריות מהזרקה תוך מי השפירה בשימוש נפוץ. הליך זה עד כה לא תואר במודל של עכברים.
Abstract
אספקת ריאתי בהריון של תאים, גנים או סוכנים תרופתיים יכולה לספק את הבסיס לאסטרטגיות טיפוליות חדשות למגוון רחב של מחלות גנטיות ונרכשות. חוץ ממומים מולדים או תורשתיים עם הדרישה לביטוי לטווח הארוך של הגן נמסר, כמה תנאים סביב לידה שאינן תורשתיים-, שבו ביטוי גנים לטווח קצר או התערבות תרופתית מספיק כדי להשיג השפעות טיפוליות, נחשבים כאינדיקציות עתידיות אפשריות לכך סוג של גישה. מחל מועמד ליישום של טיפול טרום לידתי לטווח קצר יכולות להיות מחסור בילוד הזמני של החלבון הפעיל השטח B גורם 1,2 יילודי מצוקה נשימתית תסמונת או פציעות hyperoxic של ריאות יילודי 3. מחל מועמד לתיקון טיפולי קבוע הן סיסטיק פיברוזיס (CF) 4, וריאנטים גנטיים של ליקויים פעילים שטח 5 ו חסר α1-antitrypsin 6.
<כיתת p = "jove_content"> באופן כללי, יתרון חשוב של טיפול גנטי טרום לידתי היא היכולת להתחיל התערבות טיפולית בשלב מוקדם בפיתוח, באו אפילו לפני ביטויים קליניים של המטופל, ובכך למנוע ניזק בלתי הפיך לאדם. בנוסף, איברי עובר יש קצב תרבות תאים מוגבר בהשוואה לאיברים למבוגרים, אשר עלול לאפשר גנטי יעילים יותר או העברת תאי גזע לעובר. יתר על כן, במסירת גן הרחם מבוצע כאשר המערכת החיסונית של האדם היא לא לגמרי בוגרת. לכן, השתלה של תאים או בתוספי Heterologous של חלבון שאינו תפקודי או נעדר עם גרסה נכונה לא אמורה לגרום לרגישות חיסונית התא, הווקטור או מוצר transgene, שלאחרונה הוכח במקרה של טיפולים סלולריים והן גנטיים 7 .במחקר הנוכחי, חוקרים בחן את הפוטנציאל ישירות לקנה הנשימה למקד העוברי בעכבר מ 'אודל. הליך זה נמצא בשימוש במודלים של בעלי חיים גדולים יותר כגון ארנבות וכבשים 8, ואפילו בהגדרה קלינית 9, אך עד כה לא בוצע קודם לכן במודל עכבר. כאשר לומדים את הפוטנציאל של ריפוי גנטי עוברי לטיפול במחלות גנטיות כגון CF, מודל העכבר הוא מאוד שימושי כהוכחה של המושג ראשון בגלל הזמינות הרחבה של זנים שונים מהונדסים לעכבר, embryogenesis המתועדים היטב וההתפתחות עוברת, פחות מחמירים תקנות אתיות, הריון קצר וגודל ההמלטה גדול.
דרכי גישה שונה כבר תאר למקד ריאות מכרסם העובריות, כולל הזרקה תוך 10-12 מי שפירה, הזרקה (אולטרסאונד מונחה) intrapulmonary 13,14 ועירוי לוריד לתוך כלי צק חלמון 15,16 או וריד טבור 17. הליך הכירורגים החדשני שלנו מאפשר לחוקרים להזריק את הסוכן של בחירה ישירה לקנה נשימת העכבר העוברי המאפשרלאספקה יעילה יותר לדרכי הנשימה מטכניקות קיימות 18.
Protocol
Discussion
שלבים קריטיים
- עכבר הזן שבחרנו לעבוד עם עכברים הוא NMRI כי יש להם מספר שופע של גורים (גודל ממוצע המלטה 14.4 ± 1.8, נתונים שלו), תסבול התערבויות היטב ויש להם מאפיינים אימהיים טובים.
- הצבת מחרוזת הארנק ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MC וAVdP הם דוקטורנטים נתמכים על ידי מענקים מהמכון לקידום החדשנות באמצעות מדע וטכנולוגיה בפלנדריה (IWT פלנדריה). JT מחזיק מלגה חלקית מחקר קלינית (כור) מUZ לובן. DV הוא דוקטורט בחור נתמך על ידי מענק מKU לובן, DBOF/10/062. MMdC הוא דוקטורט בחור נתמך על ידי מענק מConselho Nacional de Pesquisa הדואר Desenvolvimento (CNPq) וארסמוס מונדוס. מחקר מומן על ידי IWT פלנדריה, על ידי המענק מהקהילה האירופית דימי (LSHB-CT-2005-512146) ועל ידי בחי מולקולרי הדמית מחקר קבוצה (IMIR) מKU הלובן. ברצוננו להודות Core הווקטור UPenn נוסד על ידי ג'יימס מ 'וילסון למתנת סוגם של AAV6.2 אריזת פלסמיד לייצור וקטור rAAV.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| NMRI mice | Janvier, Le Genest St Isle, France | ||
| Isoflurane | Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, UK | ||
| Prolene 6-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgium | ||
| Vicryl 5-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgium | ||
| 50 μl Hamilton Glass Syringe, Model 1710.5 TLLX SYR | Hamilton, Reno, NV, USA | 5495-20 | |
| 30G sharp needle | Hamilton, Reno, NV, USA | 7762-03 | |
| 2% xylocaine | AstraZeneca, Zoetermeer, The Netherlands |
Riferimenti
- Willson, D. F., Notter, R. H. The future of exogenous surfactant therapy. Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).
- Abdel-Latif, M. E., Osborn, D. A. Intratracheal Clara cell secretory protein (CCSP) administration in preterm infants with or at risk of respiratory distress syndrome. Cochrane Database Syst. Rev. CD008308, (2011).
- Thebaud, B. Vascular endothelial growth factor gene therapy increases survival, promotes lung angiogenesis, and prevents alveolar damage in hyperoxia-induced lung injury: evidence that angiogenesis participates in alveolarization. Circulation. 112, 2477-2486 (2005).
- Griesenbach, U., Alton, E. W. Gene transfer to the lung: lessons learned from more than 2 decades of CF gene therapy. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 128-139 (2009).
- Aneja, M. K., Rudolph, C. Gene therapy of surfactant protein B deficiency. Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 432-438 (2006).
- Flotte, T. R., Mueller, C. Gene therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency. Hum. Mol. Genet. 20, R87-R92 (2011).
- Roybal, J. L., Santore, M. T., Flake, A. W. Stem cell and genetic therapies for the fetus. Semin Fetal Neonatal Med. 15, 46-51 (2010).
- Peebles, D. Widespread and efficient marker gene expression in the airway epithelia of fetal sheep after minimally invasive tracheal application of recombinant adenovirus in utero. Gene Ther. 11, 70-708 (2004).
- Deprest, J., Gratacos, E., Nicolaides, K. H. Fetoscopic tracheal occlusion (FETO) for severe congenital diaphragmatic hernia: evolution of a technique and preliminary results. Ultrasound Obstet. Gynecol. 24, 121-126 (2004).
- Buckley, S. M. Intra-amniotic delivery of CFTR-expressing adenovirus does not reverse cystic fibrosis phenotype in inbred CFTR-knockout mice. Mol. Ther. 16, 819-824 (2008).
- Davies, L. A. Adenovirus-mediated in utero expression of CFTR does not improve survival of CFTR knockout mice. Mol. Ther. 16, 812-818 (2008).
- Mitchell, M., Jerebtsova, M., Batshaw, M. L., Newman, K., Ye, X. Long-term gene transfer to mouse fetuses with recombinant adenovirus and adeno-associated virus (AAV) vectors. Gene Ther. 7, 1986-1992 (2000).
- Henriques-Coelho, T. Targeted gene transfer to fetal rat lung interstitium by ultrasound-guided intrapulmonary injection. Mol. Ther. 15, 340-347 (2007).
- Toelen, J. Fetal gene transfer with lentiviral vectors: long-term in vivo follow-up evaluation in a rat model. Am J Obstet Gynecol. 196, e1-e6 (2007).
- Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
- Waddington, S. N. Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy. Blood. 104, 2714-2721 (2004).
- Senoo, M. Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay. Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).
- Carlon, M. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).
- Schmiedl, A. Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).
- Buckley, S. M. Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice. Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).
