En översikt av protokollet återges i fig 1. Molecular Biology Ett. Construct Design Använd programvaran Gene Composer för att utforma protein konstruktion och kodon engineered syntetiska gensekvenser. Användningen av Gene Composer har erbjudits närmare håll 3. Använd modulen Alignment Viewer och Konstruera Design Module att jämföra inriktningar proteinsekvensdatabaser och definiera protein konstruktion. Align målaminosyrasekvensen till både den primära och 3D-strukturella element från homologer i Protein Data Bank (PDB), om sådan finns (Figur 2). Använd anpassningen information för att göra struktur-styrda konstruera mönster genom att välja nya terminaler baserade på bevarandet av den primära strukturen och 3D-strukturer homologer. Design insats PCR (IPCR) och vektor PCR (VPCR) amplimerer (plint primers). Använda Gene Composer s protein-till-DNA-algoritm, back-översätta konstruktet aminosyrasekvensen i kodon konstruerad nukleinsyrasekvens. Använd rätt bord kodonanvändningen (CUT) för att optimera sekvensen för uttryck i E. coli. Praktiskt taget klona insatsen i pET28 vektor modifierade för att innehålla en N-terminal 6x Histidin tagg och Smt3/SUMO fusionsprotein som möjliggör enkel rening. Placera syntetisk gen ordning med DNA 2.0 och primers beställa från Integrated DNA Technologies. 2. Polymeras Ofullständig Primer Extension (PIPE) Kloning Förbered Primers och gener Centrifugera från leverantören plattor innehållande primers vid 1000 rpm i 1 minut. Ta primerkoncentration till 100 | iM och tillsätt 50 | il TE-buffert. Späd primers till 10 pM med avjoniserat (DI) vatten i en 96-brunnars v-bottnad platta. Centrifugera från leverantören genen i ett 1,5 ml rör vid 1.300 rpm i 1 minut. <li> Använda TE-buffert, ta DNA-koncentrationen i varje rör till 50 ng / ul. I 1,5 ml rör, göra spädningar av varje primer till 10 ng / ul. Store primers och gener vid -20 ° C när den inte används. Förbered Infoga PCR (IPCR) Tina en injektionsflaska med Pfu Master Mix på is, hålla gener och grundfärger vid rumstemperatur. Skapa en tallrik karta tilldela brunnar till en uppsättning primrar och konstruera. Lägg 13 pl av DI-vatten i varje brunn i en 96-brunnars PCR-platta. Tillsätt 5 | il av framåt-och 5 pl av omvänd primer till varje reaktion i 96-brunnar enligt tallriksmodellen kartan, vilket garanterar att byta spetsar mellan varje brunn. Tillsätt 2 | il av varje fullängdsgen till dess lämpliga väl enligt tallriksmodellen kartan. Tillsätt 25 | il Pfu Master Mix till varje brunn, vilket garanterar att byta spetsar mellan varje brunn. Cykla reaktioner med hjälp av följande PCR-villkor: 95 ° C 2 minuter </li> 95 ° C 30 sek 50 ° C 45 sek 68 ° C 3 min 4 ° C ∞ Upprepa steg bd i 25 cykler. Överför 10 ìl av varje IPCR reaktion på en ny 96-brunnars PCR-platta. Tillsätt 3 | il 6X belastning färgämne till varje prov. Separera varje prov på en 1% TAE EtBr agarosgel vid 110 V bredvid en 100-500 bps DNA stege för att bekräfta fragment förstärkning. Affär IPCR produkten vid -20 ° C när de inte används (undvik frysning tina så mycket som möjligt). Tre. Förbered Vector PCR (VPCR) Starta övernattskultur av transformerad E. coli med pET28 vektorplasmid. Inokulera två 5 ml rör av 2-YT buljong med 50 | ig / ml kanamycin. Väx kulturer över natten vid 37 ° C i skakapparat vid 220 rpm. Centrifugera ner kulturerna efter odling över natten genom centrifugering vid 3000 rpm under 15 min. Använd en Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit för att utvinna pET28 vektor från bakteriella pellets enligt tillverkarens anvisningar. Setup restriktionsenzym spjälkningar av extraherades pET28 plasmid. Lägg 2,2 ^ il 10 x BamHI-buffert och 1 | il av BamHI och Hindlll för att 20 | il av pET28 vektor. Inkubera reaktionsblandningen under 1 h vid 37 ° C. Separat uppslutningsprodukt på en gel. Se steg 2.2.10. Klipp vektor band från gel och rena det med QIAquick Kit Gel Extraction enligt tillverkarens anvisningar. Med hjälp av en NanoDrop, kvantifiera DNA-koncentrationen. Späd skära vektorn till 10 ng / ul. Förvara vid -20 ° C när de inte används. Förbered VPCR primrar. Centrifugera IDT tillhandahålls oligonucliotides under 1 min vid 1300 rpm. Ta med koncentration till 100 | iM med DI-vatten. Bered 10 iM utspädning av både framåtriktade och bakåtriktade primrar i ett 1,5 ml rör. Store primrar och spädningar primer vid -20 ° C. Tina Pfu Master Mix på is och tina templat och primrar vid rumstemperatur. Setup VPCR reaktioner i en 96-brunnars PCR-platta: I den första raden i en 96-brunnars platta kombinera 60 pl av både framåtriktade och bakåtriktade VPCR primrar och 24 pl av digererad pET28 mall (10 ng / pl). Med hjälp av en 12-tip multikanalpipett, överföra 12 | il av primern och mall Master Mix till varje återstående brunn i plattan. Detta bör leda till 12 pl av primer och mall Master Mix i varje brunn i plattan. Lägg 13 pl av DI-vatten till varje brunn. Tillsätt 25 | il Pfu Master Mix till varje brunn. Cycle reaktionerna genom PCR-förhållanden användes i steg 2.2.7. Pool alla VPCR reaktioner i en 15 ml Falcon rör. Verifiera fragment förstärkning genom att separera 10 il poolad PCR-produkten på en gel (förväntad längd av rötat pET28 vektorär ca 6 kb). Se steg 2.2.10. Förbered samman plattorna. Alikvot 3 pl VPCR produkt i varje brunn i en 96-brunnars v-bottnad platta. Förvara plattorna vid -20 ° C tills merge med IPCR produkt. 4. Merge IPCR och VPCR Produkter Tina IPCR produkter och pre-alikvoteras VPCR 96-brunnars sammanfoga plattan vid rumstemperatur. Tillsätt 3 l av varje IPCR produkt till respektive brunn sammanfogningen plattan. Förvandla samman plattan i Top Ten kemiskt kompetenta celler. Tillsätt 2 l av varje Merge reaktion i ett enda 50 pl tub från leverantören kemiskt kompetenta celler och fortsätt med tillverkarens medföljande protokoll. Förbered övernattskulturer för varje konstruktion från transformation plattan. Alikvot 5 ml TB-buljong (med 50 | ig / ml kanamycin) från en 25 ml steril reservoar i varje brunn i en djup brunn blocket. Använda sterile teknik, plocka en isolerad koloni från varje omvandling platta och ympa rätt väl av den djupa brunnen blocket. Täck blocket med en Airpore lock. Skaka block vid 220 rpm vid 37 ° C över natten. Pelletera celler genom centrifugering av blocket under 30 min vid 4000 rpm. Häll av supernatanten och klappa den övre delen av blocket torr med en pappershandduk. Mini-prep med användning av en Qiagen 96-brunnars vakuumapparat enligt tillverkarens anvisningar. Fem. Förbereda glycerolstamlösningar framgångsrikt Klonade Konstruktioner Omvandla framgångsrikt klonade sekvensen validerade DNA i BL21 (DE3) kemiskt kompetenta celler enligt tillverkarens instruktioner. För varje konstruktion, plocka en enda isolerad koloni från BL21 (DE3) omvandling och inokulera i 1 ml 2-YT-buljong (med 50 ug / ml kanamycin). Skaka kulturer vid 220 varv per minut under 3-4 h vid 37 ° C. Märk ett 1,5 mlprovrör med skruvlock med den unika konstruktionen identifieringsnummer, cellstam, och datum. Lägg 500 pl av 50% glycerol och 500 pl av cellodling och vänd flera gånger. Omedelbart lagra glycerol lager på torr is eller i en -80 ° C frys. 6. Expression Testing Lysis Buffe r Tvättbuffert Elueringsbuffert 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8,0 300 mM NaCl 10 mM imidazol 1% Tween 20 2 mM MgCl2 0,1 pl / ml Benzonase 1 mg / ml Lysozym 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8,0 300 mM NaCl 20 mM imidazol 0,05% Tween 20 25 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 250 mM imidazol 0,05% Tween 20 * Lägg Benzonase, lysozym,och proteas-inhibitor omedelbart före lys. Streak ett prov från glycerol mald på kanamycin selektiv agar och inkubera över natten vid 37 ° C. Starta en icke-inducerande pre-kultur i en 96-brunnars rundbottnad block; inokulera 1,2 ml TB-buljong (med 50 mg / ml kanamycin) kompletterat med 0,5% glukos med en nyligen odlas E. coli isolat. Grow över natten under skakning vid 220 rpm vid 37 ° C. Efter odling över natten, börja induktion kulturer genom inokulering av 1,2 ml av TB-buljong (med 50 mg / ml kanamycin) kompletterat med Novagen Overnight Express System 1 (enligt tillverkarens protokoll) med 40 | il av pre-kulturen. Odla småskaliga induktion kulturer vid 20 ° C under 48 h, skakning vid 220 rpm. Harvest celler genom centrifugering vid 4000 rpm under 15 minuter, häll bort supernatanten och förvara vid -20 ° C i minst 1 h före bearbetning. I 96-brunnars blocket, resuspendera cellpelletar i 300 | il lysbuffert. </li> Inkubera cellerna i lysbuffert vid rumstemperatur under 30 min följt av mekanisk lys genom kraftig skakning under 30 min vid rumstemperatur. Klargörande av råa lysatet genom centrifugering under 30 min vid 4000 rpm vid 4 ° C. Använd en flerkanals pipett för att överföra 200 fil av det klargjorda lysatet (löslig fraktion) till en 96-brunnars flatbottnad bricka (Qiagen). För varje brunn innehållande ett prov, tillsätt 40 | il Ni-NTA-magnetiska pärlor (Qiagen). Skaka försiktigt plattan på en vippa under 1 h vid 16 ° C. Placera plattan på en magnetisk post platta (Qiagen) och avlägsna den obundna fraktionen. Var noga med att inte pipettera ut någon av Ni-NTA-pärlor. Avlägsna plattan från posten plattan och försiktigt suspenderades pärlorna i 200 mikroliter tvättbuffert. Pipettera upp och ner i 30 sekunder och sedan placera plattan tillbaka på posten plattan. Avlägsna tvättbufferten och upprepa steg 6.12. Avlägsna plattan från posten plattan och eluera Ni-NTA bundet TArget protein genom tvättning med 50 pl elueringsbuffert under 5 min. Återgå flatbottnad platta till magnetisk post plattan och överföra eluering för en frisk 96-brunnars v-bottnad platta. Överför 20 ul av eluering för en färsk 96-brunnars v-bottnad platta och reagerar med ett pl ULP1 proteas. Enligt tillverkarens protokoll, analysera eluerade och eluerade + Ulp1 fraktionen genom kapillär elektrofores med en LabChip 90. Alternativt kan alla fraktioner från uttrycket testning analyseras via SDS-PAGE. 7. Large Scale Jäsning Använd en steril pipettspets för erhållande av en skrapa från en glycerolstock, inokulera 100 ml TB-buljong (med 50 mg / ml kanamycin) och växa över natt. Skaka vid 220 rpm och 37 ° C. Efter odling över natten, expandera förkultur genom inokulering en L av TB-buljong med EMD autoinduktion lösningar (se tillverkarens protokoll) (med 50 mg / ml kanamycin) i en 2 L bafflad kolv med 10 ml av denpre-kultur (1:100 utspädning). Skaka de expanderade 1 L kulturer vid 37 ° C, ändra temperaturen hos skakinkubator till 20 ° C då en optisk densitet på 0,6 (OD 600) har uppnåtts. Efter odling över natten, ta ett representativt 10 ml alikvot från varje konstruktion för uttryck testning. Harvest cellpasta genom centrifugering vid 5000 rpm under 15 min och kassera supernatanten. Freeze cellpasta vid -80 ° C. Proteinrening Buffertar: Lysis Buffer Buffert A (Jämvikt) Buffert B (Eluering) Dimensionering kolonnbuffert 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 0,5% glycerol 0,02% CHAPS 10 mM imidazol 1 mM TCEP 50 mM Arginin 5 pl Benzonase 100 mg Lysozym 3 Proteasinhibitor Tabletter (EDTA-fri) 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 10 mM imidazol 1 mM TCEP 50 mM Arginin 0,25% glycerol 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 200 mM imidazol 1 mM TCEP 25 mM Tris, pH 8,0 200 mM NaCl 1% glycerol 1 mM TCEP * Lägg Benzonase, lysozym, och proteashämmare tabletter hämmare till vardera 150 ml prov omedelbart före lys. 8. Cell Lysis Gör 2 L lysbuffert, inte lägga lysozym, proteas tabletter inhibitor eller Benzonase (varje prov skall lyseras separat i 150 ml lysbuffert). Tina och återsuspendera cellpasta i lysbuffert vid en 01:05 vikt: volymförhållande genom kraftig omröring i 30 min vid 4 ° C. Bryt bitar loss från sidorna av bägare med en ren spatel. Under denna tidsperiod förbereda Ni och Dialysis Buffertar På is, lysera cellerna med hjälp av en Misonix sonikator (70% effekt, 2 sek på / 1 sekund av pulser under 3 min) och snurra försiktigt behållare för att förhindra överhettning. Spara en liten (200 ^ il) alikvot av rålysat för framtida analys. Klargörande av rått lysat genom centrifugering vid 18.000 xg under 35 minuter vid 4 ° C, samla in supernatanten och spara en liten (200 ^ il) alikvot för framtida analys. Store pellet vid 4 ° C tills det är bekräftat proteinet har lyserats in i den lösliga fraktionen. 9. Pre-run Protein Maker Setup Med proteinet Maker påslagen och programvaran öppnas, initiera instrumentet. När initierats, bifoga en 5,0 ml GE Healthcare HisTrap FF Nickel-kelat-kolonn (Ni kolumn) på en separat rad i portalen för varje prov. Kör 3-4 kolonnvolymer (CV) jämviktsbuffert genom varje kolonn. Prime ekvilibreringen och elueringstider linjer buffert. Equilibråt kolumnerna genom att aspirera buffert A genom kolonnen gång. 10. Nickel 1 (Ni1) Kolumn Tvätta varje kolonn med 20 ml Milli-Q-vatten för att avlägsna lagring buffert. Springa 5 ml buffert B och 25 ml buffert A till jämvikt. Ladda det klarnade lysat innehållande solubiliserade proteinet i kolonnerna med en hastighet av 2 ml / min följer sedan genom en 15 ml tvätt med buffert A. Eluera det bundna proteinet i en steggradient med buffertar A och B genom följande förhållanden respektfullt: 5 ml 95:5, 5 ml 60:40, 10 ml 0:100. Samla varje elueringsfraktion separat. Analysera: eluerade fraktionerna, rålysat, klarnat lysat och genomflöde genom SDS-PAGE. Pool fraktioner innehållande proteinet och använda en Nanodrop att mäta A 280 för att grovt bestämma mängden protein som är närvarande. 11. ULP1 Klyvning Håll en liten portion (250 ul) av Ni1 kolumnen poolen för efterföljande gelanalys. Ta restenav Ni1 poolen till 10 ml och tillsätt ubiquitin-liknande proteas 1 (ULP1) vid 1 | il / 5 mg totalt protein för att avlägsna His-Smt affinitetsmärkning. Dialysera Ni1 pool + ULP1 mot 2 L buffert A under 4 h vid 4 ° C i en 10 kDa molekylvikt cutoff (MWCO) på en uppståndelse plattan vid 4 ° C. Efter dialys köra SDS-PAGE av Ni1 pool och Ni1 pool + ULP1 att bestämma om ULP1 klyvning lyckades. 12. Nickel 2 (Ni2) Kolumn Ladda kluvna proteinet över samma Ni-kolonn och upprepa steg 9,3 till en reducerad flödeshastighet av 1 ml / min. Den klyvda av tagg kommer att binda till kolonnen och tagless målproteinet strömmar nu-through. Samla genomflödet i en fräsch behållare. Tvätta Ni kolonnen med 3 ml buffert A följt av 5 ml av buffert B för att eluera alla His-märkt och icke-specifikt bundet protein. Samla varje fraktion separat. Kör SDS-PAGE av Ni2 genomströmning, tvätta och Ni2 fraktioner elueringsbetingelser att kontrollera ULP1 klyvning och att protein är närvarande i genomflödet. Använd en Nanodrop att mäta A 280 för att grovt bestämma närvaron av protein. 13. Koncentrera Koncentrera Ni2 genomströmning (och Ni2 eluering om proteinet är närvarande) till 5 ml med en Amicon Ultra 10 kDa MWCO centrifugrör. Spin i 10 minuters intervall vid 4000 rpm vid 4 ° C. Blanda med en pipett mellan varje dragning för att undvika protein från över-koncentrera längs membranet. 14. Storleksuteslutningskromatografi (SEC) Sätt upp en Sephacryl S-100 10/30 GL kolonn (GE Healthcare) genom ekvilibrering med 200 ml SEC-buffert vid en flödeshastighet av 0,5 ml / min på en AKTApurifier systemet (GE Healthcare). Bered 10 ml superloops för användning på SEC-kolonn enligt tillverkarens instruktioner. Med hjälp av en 5 ml spruta, ladda prover på superloops och börja SEC körningen. Övervaka UV-absorbans spår vid 280 nm samtidigt samla liten volym fråtgärder. Kör SEC fraktionerna via SDS-PAGE. Pool Den SEC fraktionerna visar den högsta intensiteten banden. Koncentrera poolade SEC fraktioner. Se steg 13,1. Alikvot protein i 100 ul prover, flash frysa i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C. KRISTALLISERING 15. Protein Kristallisation Pre-fylla varje reservoar av en 96-brunnars Kompakt Jr kristallisering platta (Emerald Bio) med 80 pl av kristallisering skärm (Emerald Bio) av valet. Späd protein med dimensionering buffert till 2-20 mg / ml och förvara på is. Fördela 0,4 pl av protein och 0,4 pl av kristallisering skärmen i vart och ett av de 96-brunnar och täck med kristallklart fogband (Manco). Förvara plattan vid 16 ° C när du söker efter proteinkristallisering regelbundet under de närmaste veckorna under ett dissekera mikroskop. 16. Crystal Skörd </ P> Skapa ett kryoskyddande medel från moderluten och etylenglykol. Skär den klara tejpen som täcker väl med målproteinet kristall. Till en tom väl, tillsätt 1,6 | il av den motsvarande kristalliserande tillstånd och kombinera med 0,4 | il etylenglykol vilket ger en slutlig koncentration av 20% etylenglykol och 80% kristalliserande skick. Observera: att optimera kristall diffraktion prova olika kryoskyddsmedel såsom: glycerol, oljor, låg MW polyetylenglykoler, och / eller vid olika procentsatser av frysskyddsmedel. Innan skörd svalna en ALS-stil pucken i en dewar fylld med flytande kväve och täck med lock. Harvest kristallen genom att placera en CryoLoop med innerdiametern likvärdig storleksfördelning av kristallen på en magnetisk Crystal Wand (Hampton Research) och skopa den direkt från väl lösningen. Omedelbart doppa CryoLoop med den skördade kristallen i kryoskyddsmedlet sedan dränka i ALS-stil puck att blinka frysa crystal. Upprepa för ett önskat antal kristaller. 17. Crystal Screening / datainsamling När skörden är klar att använda en puck trollstav att placera magnetiska Cryo pucken locket på ALS pucken. Med böjda tänger, vända pucken upp och ner. Överför pucken till en Rigaku ACTOR Dewar, skruva en Puck Pusher på pucken, och slå av locket lämnar den i Dewar med stiften uppåt. Använda JDirector programvara, skärm varje kristall under följande parametrar: balk slits inställd på 0,5 grader, detektor avstånd satt till 50 mm, bild steg till 70 grader, och exponering längd inställd på 30 sek. Kör MOSFLM på testbilder du tagit med JDirector att avgöra vad det bästa kristall och strategi är för datainsamling. Samla ett komplett dataset baserat på dina resultat från MOSFLM. 18. Data Processing / Structure Determination Kör XDS / XSCALE 4 för att bearbeta datamängden. Öppna CCP4 Suite. Kör Phaser 5 för att beräkna en molekylär ersättare lösningen med en hög modell homologisökning, när det finns. I det här fallet använde vi PDBID 3CW4 som sökmodellen 6. Kör REFMAC 7 för att förfina din molekylära modell mot den observerade reflektion samlats i datamängden. Slutlig upplösning bör baseras bort av högsta skalet och bestäms av följande parametrar: R faktor> 50%, I / sigma> 2, och fullständighet> 90%. Bygg en 3-dimensionell modell elektrontätheten med molekylära grafikprogram COOT 8. Innan de deponerar strukturen i det preliminära budgetförslaget validera den med MolProbity 9 programvara för att kontrollera att kvaliteten på konstruktionen är lämplig för deponering.