Visualisation des réponses toxine bactérienne induite en utilisant direct microscopie de fluorescence cellulaire

Summary

Méthodes de purification du cholestérol contraignant toxine streptolysine O de recombinaison<em> E. coli</em> Et la visualisation de liaison de la toxine à vivre cellules eucaryotes sont décrits. Application locale de la toxine induit des changements rapides et complexes dans les cellules ciblées révélant de nouveaux aspects de la biologie toxine.

Abstract

Toxines bactériennes se lier au cholestérol dans les membranes, en formant des pores qui permettent une fuite du contenu cellulaire et l'afflux de matériaux provenant de l'environnement extérieur. La cellule peut soit se remettre de cette insulte, ce qui nécessite actifs des processus de réparation des membranes, ou mourir en fonction de la quantité d'exposition aux toxines et ¹ type de cellule. En outre, ces toxines induisent de fortes réactions inflammatoires chez les hôtes infectés par l'activation des cellules immunitaires, dont les macrophages, qui produisent une gamme de cytokines pro-inflammatoires ^2. De nombreuses bactéries Gram-positives produisent des toxines cholestérol contraignants qui ont été montrés pour contribuer à leur virulence en grande partie grâce à des mécanismes non caractérisés.

Des changements morphologiques dans la membrane plasmique des cellules exposées à ces toxines comprennent leur séquestration dans les protubérances de surface cholestérol enrichis, qui peuvent être versées dans l'espace extracellulaire, ce qui suggère une défense cellulaire intrinsèqueMécanisme ^3,4. Ce processus se produit sur ​​toutes les cellules en l'absence de l'activité métabolique, et peuvent être visualisées à l'aide EM au bout de ⁴ fixation chimique. Dans les cellules immunitaires comme les macrophages, qui interviennent dans l'inflammation en réponse à l'exposition aux toxines, des vésicules membranaires induits sont suggérées pour contenir cytokines de la famille IL-1 et peut être responsable à la fois pour l'excrétion des toxines et la diffusion de ces cytokines pro-inflammatoires ^5,6,7. Un lien entre l'IL-1β libération et un type spécifique de mort cellulaire, appelée pyroptosis a été suggéré, car les deux sont des processus caspase-1 dépendantes ^8. Pour démêler les complexités de cette réponse des macrophages, ce qui inclut la liaison toxine, l'excrétion de vésicules membranaires, la libération de cytokines et la mort cellulaire potentiellement, nous avons développé des techniques d'étiquetage et les méthodes de microscopie par fluorescence qui permettent de visualiser en temps réel des toxines cellulaires des interactions, y compris mesures de dysfonctionnement et la mort (figure 1). Utiliserd'imagerie des cellules vivantes est nécessaire en raison des limitations dans d'autres techniques. Approches biochimiques ne peut pas résoudre effets qui se produisent dans des cellules individuelles, tout en cytométrie en flux n'offre pas de haute résolution, visualisation en temps réel des cellules individuelles. Les méthodes décrites ici peuvent être appliqués à l'analyse cinétique des réactions induites par des stimuli complexes impliquant d'autres changements phénotypiques dans les cellules.

Protocol

1. Purification de streptolysine O (SLO) Inoculer 20 ml de culture de nuit de cellules BL21 contenant le plasmide GOLD pBADgIII-SLOhis 9 dans 0,5 L de bouillon LB et ajouter 500 ul de 50 mg / ml d'ampicilline. Secouez la culture à 225 rpm à 37 ° C jusqu'à DO600 = 0,6, habituellement ~ 1,5 h. Centrifuger 1 ml (bactéries considérées T 0) à 10.000 xg 5 min, dissoudre le culot dans tampon 140 pi d'échantillon SDS 1x / 1 OD et soniquer à l'ADN de cisaillem…

Representative Results

Typiquement 10 7 -10 8 U / ml SLO peut être obtenue avec une concentration en protéines de 4 mg / ml. La quantité de toxine nécessaire pour la lyse des cellules varie selon le type cellulaire, mais elle est généralement de 125 à 500 U / ml SLO (figure 2B). Types de cellules comme les macrophages peuvent être plus résistantes (4000 U / ml) alors que d'autres (en particulier des lignées de cellules T) sont plus sensibles. Ces sensibilités correspondre avec SLO disponib…

Discussion

Les techniques décrites ici permettent l'examen des réponses des cellules immunitaires à des toxines bactériennes. L'étape la plus critique est la manipulation et le dosage de la toxine. Activité de la toxine peut être extrêmement variable, même entre différentes aliquotes de la même préparation, en raison de sa fragilité. Cela nécessite soit l'essai de chaque aliquote de la toxine contre une lignée cellulaire de référence ou globules rouges ou en utilisant des gradients de toxines. Gradient…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
			Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
			Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.