Visualisierung der bakteriellen Toxin induzierten Reaktionen mit Live Cell Fluoreszenzmikroskopie

Summary

Verfahren zur Reinigung des Cholesterins Bindung Toxin Streptolysin O aus rekombinanten<em> E. coli</em> Und Visualisierung von Toxin Bindung an eukaryotischen Zellen leben beschrieben. Lokalisierte Abgabe von Toxin induziert eine schnelle und komplexe Veränderungen in Zielzellen enthüllen neue Aspekte des Toxins Biologie.

Abstract

Bakterielle Toxine binden an Cholesterin in Membranen, Bildung von Poren, die auf Undichtigkeiten des Zellinhalts und Einströmen von Material von der äußeren Umgebung ermöglichen. Die Zelle kann entweder ins Insult, die Wirkmembran Reparaturprozesse erfordert wiederherzustellen, oder sterben abhängig von der Menge des Toxins Belichtung und ^ein Zelltyp. Darüber hinaus führen diese Toxine starke entzündliche Reaktionen in infizierten Wirten durch Aktivierung von Immunzellen, einschließlich Makrophagen, die ein Array von pro-inflammatorischen Zytokinen ^{2 zu} erzeugen. Viele Gram-positive Bakterien produzieren Cholesterin bindenden Toxine, die gezeigt haben, um ihre Virulenz durch weitgehend charakterisierten Mechanismen beitragen.

Morphologischen Veränderungen in der Plasmamembran von Zellen, die diese Toxine umfassen ihre Sequestrierung in Cholesterin angereicherten Oberflächenprotrusionen, die in den extrazellulären Raum vergossen werden kann, was auf eine intrinsische zelluläre AbwehrMechanismus ^3,4. Dieser Vorgang geschieht für alle Zellen in Abwesenheit einer metabolischen Aktivität und visualisiert werden kann, nachdem mit EM chemischen Fixierung ^4. In Immunzellen wie Makrophagen, die Entzündung als Reaktion auf Exposition Toxin vermitteln, induziert werden Membranvesikel vorgeschlagen, Zytokine der IL-1-Familie enthalten und kann sowohl für vergießen Toxin und Weiterleitung dieser proinflammatorischen Zytokine ^5,6,7. Eine Verbindung zwischen IL-1β Freisetzung und einer bestimmten Art von Zelltod genannt hat pyroptosis vorgeschlagen worden, da beide Caspase-1-abhängiger Prozesse sind ^8. So sortieren Sie die Komplexität dieser Makrophagen Antwort, die Toxinbindung, vergießen Membranvesikel Zytokinfreisetzung und potenziell Zelltod enthält, haben wir die Kennzeichnung Techniken und Fluoreszenzmikroskopie Methoden, die für Echtzeit-Visualisierung von Toxin-Zell-Interaktionen ermöglichen, einschließlich entwickelt Messungen der Dysfunktion und Tod (Abbildung 1). Verwendendes Live Cell Imaging ist notwendig wegen der Beschränkungen in anderen Techniken. Biochemische Ansätze nicht lösen können auftretenden Effekte in einzelnen Zellen, während Durchflusszytometrie nicht bieten hohe Auflösung, Echtzeit-Visualisierung von einzelnen Zellen. Die hier beschriebenen Methoden können zur kinetischen Analyse der Antworten durch andere Reize mit komplexen phänotypischen Veränderungen in Zellen induziert aufgebracht werden.

Protocol

Ein. Reinigung von Streptolysin O (SLO) Beimpft 20 ml Übernacht-Kultur von BL21 GOLD Zellen mit pBADgIII-SLOhis Plasmid 9 in 0,5 L LB-Brühe und 500 ul 50 mg / ml Ampicillin. Schüttelkultur bei 225 UpM bei 37 ° C bis OD600 = 0,6, in der Regel ~ 1,5 Stunden. Zentrifuge 1 ml Bakterien (als T 0) bei 10.000 xg 5 min auflöst Pellet in 140 ul 1x SDS Probenpuffer / 1 OD und beschallen zu scheren DNA auf Proteinreinheit Analyse. Bakterien induzieren unter Zusatz von 5 ml…

Representative Results

Typischerweise 10 7 -10 8 U / ml SLO kann mit einer Proteinkonzentration von 4 mg / ml erzielt werden. Die Menge des Toxins zur Zelllyse benötigt je nach Zelltyp, aber üblicherweise 125 bis 500 U / ml SLO (2B). Zelltypen wie Makrophagen widerstandsfähiger (4000 U / ml), obwohl andere (vor allem T-Zelllinien) empfindlicher sind. Diese Sensitivitäten mit handelsüblichen SLO entsprechen. Toxinaktivität abnimmt etwa 2-fach mit jedem Frost-Tau, so hämolytischen Assays mit jeder C…

Discussion

Die hier beschriebenen Techniken ermöglichen die Untersuchung der Reaktionen von Immunzellen, um bakterielle Toxine. Der wichtigste Schritt ist die Handhabung und Dosierung des Toxins. Toxinaktivität kann äußerst variabel, sogar zwischen verschiedenen Aliquots derselben Zubereitung, aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit. Dies erfordert entweder eine Prüfung jedes einzelnen Aliquot des Toxins gegen eine Referenz Zelllinie oder RBCs oder mit Toxin Steigungen. Toxin Gradienten, wie Mikropipette geliefert, damit das gesamte …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
			Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
			Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.