라이브 세포 형광 현미경을 사용하여 박테리아 독소 유도 응답의 시각화

Summary

재조합에서 콜레스테롤 바인딩 독소 streptolysin O를 정화하기위한 방법<em> E. 대장균</em진핵 세포를 사는 바인딩 독소> 및 시각화가 설명되어 있습니다. 독소의 현지화 배달 독소 생물학의 소설 측면을 드러내는 대상 셀에 신속하고 복잡한 변화를 유도한다.

Abstract

세균 독소는 세포 내용과 외부 환경으로부터 물질의 유입을 누설 할 수 있도록 모공을 형성 세포막에 콜레스테롤에 바인딩. 셀은 운영 중 막 복구 프로세스가 필요합니다이 모욕, 복구, 또는 다른 독소 노출과 셀 타입 ^1의 양에 따라 죽을 수 있습니다. 또한 이러한 독소는 프로 염증성 크린 시토 킨 ² 배열을 생산 식세포 등의 면역 세포의 활성화를 통해 감염된 호스트에 강한 염증 반응을 유도. 대부분의 그람 양성 세균은 대부분 uncharacterized 메커니즘을 통해 독성에 기여하는 표시되었습니다 콜레스테롤 구속력이 독소를 생성합니다.

이러한 독소에 노출 세포의 플라즈마 막에 Morphologic 변화는 본질적인 세포 방어를 제안, 세포 공간으로 발산 할 수 있습니다 콜레스테롤 강화 표면 돌기들에 대한 자신의 격리를 포함메커니즘 ^3,4. 이 과정은 신진 대사 활동의 부재에있는 모든 세포에서 발생, 화학 고정 ⁽⁴⁾ 후 EM을 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 이러한 독소 노출에 대한 응답으로 염증을 중재 대 식세포와 같은 면역 세포에서 유도 막 소포는 IL-1 가족의 크린 시토 킨를 포함하도록 제안하고 독소를 흘리는 이러한 프로 염증성 크린 시토 킨 ^5,6,7을 전파 모두에 책임이있을 수 있습니다. 모두 ⁸ caspase-1에 의존 프로세스입니다으로 IL-1β 자료 및 세포 죽음의 특정 유형 사이의 링크를 칭했다 pyroptosis이 제안되었습니다. 막 소포의 독소 바인딩, 개구, 시토 킨 릴리스, 그리고 잠재적으로 세포 사망을 포함이 대 식세포 반응의 복잡성을 해결하기 위해, 우리는 다음과 같은 독소 세포의 상호 작용 실시간으로 시각화 할 수 있도록 라벨 기술과 형광 현미경 방법을 개발 장애와 죽음의 측정 (그림 1). 사용라이브 셀 이미징의 다른 기술의 한계로 인해이 필요합니다. 유동 세포 계측법은 개별 세포의 고해상도, 실시간 시각화를 제공하지 않습니다 동안 생화학 접근 방법은 개별 셀에서 발생하는 효과를 확인할 수 없습니다. 여기에 설명 된 방법은 세포에서 복잡한 phenotypic 변화를 포함하는 다른 자극에 의​​해 유도 반응의 운동 분석에 적용 할 수 있습니다.

Protocol

1. Streptolysin O의 정화 (SLO) 0.5 L의 LB의 국물에 플라스미드 pBADgIII-SLOhis 9 포함 BL21 GOLD 세포의 20 ML 밤 문화의 예방 500 μl 50 MG / ML 암피실린을 추가합니다. 37 ° C에서 225 rpm으로 문화를 흔들어 OD 600까지 = 0.6은, 보통 1.5 시간을 ~. 10,000 5 분 XG에서 1 ML 박테리아를 (T 0으로 간주) 원심 분리기, 140 μl 1X SDS 샘플 버퍼 / 1 OD에서 펠렛을 분해하고 단백질 순도 분석에 전단 DNA에 s…

Representative Results

일반적으로 10 7 -10 8 U / ML SLO은 4 MG / ML의 단백질 농도를 구할 수 있습니다. 세포 용해에 필요한 독소의 양이 세포 유형에 따라 다르며, 보통 125-500 U / ML SLO (그림 2B)입니다. 다른 사람들이 (특히 T 세포 라인) 더 민감하지만 식세포와 같은 세포 유형 (4,000 U / ML) 더 내성이 될 수 있습니다. 이러한 민감한 상업적으로 사용할 수 SLO와 일치합니다. 독소 활동은 독소의 각 배?…

Discussion

기술은 박테리아 독소에 대한 면역 세포의 반응을 시험 할 수 여기에 설명했다. 가장 중요한 단계는 독소의 처리와 주입합니다. 독소 활동도의 취약성으로 인해 같은 준비의 다른 aliquots 사이에 매우 변수가 될 수 있습니다. 이 중 참조 셀 라인 또는 적혈구에 대한 독소의 각 나누어지는을 테스트하거나 독소의 그라디언트를 사용하여 필요로. 독소 그라디언트는 등 micropipette에 의해 전달, 실시간?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
			Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
			Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.