Использование первичных фибробластов человека для мониторинга митохондриальной фенотипы в области болезни Паркинсона
Summary
Фибробласты от пациентов, несущих мутации в болезнетворные гены Паркинсона представляет собой легко доступны<em> Бывших естественных условиях</em> Модель для изучения болезней связанных фенотипов. Изображений живых клеток дает возможность изучить морфологические и функциональные показатели в живых клетках. Здесь мы опишем подготовки человеческих фибробластов и последующего контроля митохондриальной фенотипов.
Abstract
Болезнь Паркинсона (БП) является вторым наиболее распространенным нарушением движения и влияет на 1% людей в возрасте старше 60 1. Поскольку старение является наиболее важным фактором риска, случаи PD увеличится в течение следующего десятилетия 2. Рядом с патологическим складывающиеся белка и нарушение путей деградации белков, изменения функции митохондрий и морфологии были отмечены как дальнейшее признак нейродегенерации в PD 3-11.
После многих лет исследований в мышиных и человеческих раковых клеток, как в пробирке моделей, чтобы анализировать молекулярных путей, болезни Паркинсона, использование человеческих фибробластов у пациентов и соответствующие меры контроля для бывших моделей естественных стал ценным инструментом исследования, если потенциальный предостережения считаются. Кроме увековечена, а искусственные модели ячейки, первичные фибробласты от пациентов проведение болезни мутации, связанные, очевидно, отражают важные патологические особенности оF заболевания человека.
Здесь мы разграничить процедуру принятия биопсии кожи, культивирование фибробластов человека и с помощью подробных протоколов для основных микроскопических методов для определения митохондриальной фенотипов. Они были использованы для изучения различных особенностей, связанных с PD, которые относятся к митохондриальной функции и динамика. EX VIVO, митохондрии могут быть проанализированы с точки зрения их функции, морфологии, колокализации с лизосом (органеллы, унижающие дисфункциональные митохондрии) и деградации через лизосомальных пути . Эти фенотипы являются крайне актуальными для выявления ранних признаков PD и может предшествовать клинические симптомы двигатель в человеческих болезней носителей гена. Таким образом, тесты, представленные здесь может быть использован как ценный инструмент для выявления патологических особенностей нейродегенерации и поможет определить новые терапевтические стратегии в PD.
Protocol
Discussion
Фибробласты кожи пациента, как бывший моделей естественных условиях представляют собой важный инструмент для описания болезней связанных с ними генетических дефектов. Кроме того, кожа полученных фибробласты легко доступны и могут быть расширены при культивировании. Таким ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Фонда Фрица Тиссена (10.11.2.153 в РК), немецкий исследовательский совет (ДФГ, KR2119/3-2 и KR2119/8-1 в РК), Федеральное министерство образования и научных исследований (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 в РК) и докторскую стипендию от благотворительного фонда Hertie [в LFB]. Мы благодарим Каролин Obermaier и Юлия Westermeier за их поддержку во время видеосъемки.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue no. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Invitrogen | 52400-025 |
| RPMI 1640 medium, no Phenol Red | Invitrogen | 11835-063 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-094 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 100-18B |
| AccuMax (detachment solution) | PAA | L11-008 |
| Lab-TekTMII chambered coverglasses | Nalge Nunc International | 115382 |
| Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) | Invitrogen | T-669 |
| Mitotracker Green FM | Invitrogen | M-7514 |
| Mitotracker CM-H2XRos | Invitrogen | M-7513 |
| Lyostracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
Riferimenti
- de Rijk, M. C., Launer, L. J., Berger, K., Breteler, M. M., Dartigues, J. F., Baldereschi, M., Fratiglioni, L., Lobo, A., Martinez-Lage, J., Trenkwalder, C. Prevalence of Parkinson’s disease in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Neurology. 54, 21-23 (2000).
- Dorsey, E. R., Constantinescu, R., Thompson, J. P., Biglan, K. M., Holloway, R. G., Kieburtz, K., Marshall, F. J., Ravina, B. M., Schifitto, G., Siderowf, A. Projected number of people with Parkinson disease in the most populous nations. Neurology. 68, 384-386 (2005).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature. 388, 839-840 (1997).
- Chung, K. K., Zhang, Y., Lim, K. L., Tanaka, Y., Huang, H., Gao, J., Ross, C. A., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Parkin ubiquitinates the alpha-synuclein-interacting protein, synphilin-1: implications for Lewy-body formation in Parkinson disease. Nature. 7, 1144-1150 (2001).
- Kruger, R., Eberhardt, O., Riess, O., Schulz, J. B. Parkinson’s disease: one biochemical pathway to fit all genes. Trends Mol. Med. 8, 236-240 (2002).
- Krebiehl, G., Ruckerbauer, S., Burbulla, L. F., Kieper, N., Maurer, B., Waak, J., Wolburg, H., Gizatullina, Z., Gellerich, F. N., Woitalla, D. Reduced basal autophagy and impaired mitochondrial dynamics due to loss of Parkinson’s disease-associated protein DJ-1. PLoS One. 5, e9367 (2010).
- Exner, N., Treske, B., Paquet, D., Holmstrom, K., Schiesling, C., Gispert, S., Carballo-Carbajal, I., Berg, D., Hoepken, H. H., Gasser, T. Loss-of-function of human PINK1 results in mitochondrial pathology and can be rescued by parkin. J. Neurosci. 27, 12413-12418 (2007).
- Burbulla, L. F., Krebiehl, G., Kruger, R. Balance is the challenge–the impact of mitochondrial dynamics in Parkinson’s disease. European journal of clinical investigation. 40, 1048-1060 (2010).
- Strauss, K. M., Martins, L. M., Plun-Favreau, H., Marx, F. P., Kautzmann, S., Berg, D., Gasser, T., Wszolek, Z., Muller, T., Bornemann, A. Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson’s disease. Human molecular genetics. 14, 2099-2111 (2005).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. The Journal of cell biology. 183, 795-803 (2008).
- Dagda, R. K., Cherra, S. J., Kulich, S. M., Tandon, A., Park, D., Chu, C. T. Loss of PINK1 function promotes mitophagy through effects on oxidative stress and mitochondrial fission. The Journal of biological chemistry. , 284-13843 (2009).
- Kieper, N., Holmstrom, K. M., Ciceri, D., Fiesel, F. C., Wolburg, H., Ziviani, E., Whitworth, A. J., Martins, L. M., Kahle, P. J., Kruger, R. Modulation of mitochondrial function and morphology by interaction of Omi/HtrA2 with the mitochondrial fusion factor OPA1. Experimental cell research. 316, 1213-1224 (2010).
- Burbulla, L. F., Schelling, C., Kato, H., Rapaport, D., Woitalla, D., Schiesling, C., Schulte, C., Sharma, M., Illig, T., Bauer, P. Dissecting the role of the mitochondrial chaperone mortalin in Parkinson’s disease: functional impact of disease-related variants on mitochondrial homeostasis. Human molecular genetics. 19, 4437-4452 (2010).
- Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Nguyen, H. N., Byers, B., Cord, B., Shcheglovitov, A., Byrne, J., Gujar, P., Kee, K., Schule, B., Dolmetsch, R. E., Langston, W. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).
- Seibler, P., Graziotto, J., Jeong, H., Simunovic, F., Klein, C., Krainc, D. Mitochondrial Parkin recruitment is impaired in neurons derived from mutant PINK1 induced pluripotent stem cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5970-5976 (2011).
