기능 Assays을위한 조직 항원의 추출
Summary
기능 T-세포 assays에서 항원의 소스로 사용되는 인체 조직의 추출물을 준비하기위한 간단한 프로토콜은 설명되어 있습니다. 이 방법은 조직 유래 항원에 대한 T 세포 반응을 측정 할 수 있습니다<em> 체외에서</em>.
Abstract
B와 T 세포에 의해 인식 적응 면역 반응의 항원 대상, 대부분은 1 정의되지 않았습니다. 이 면역 질환과 암 2 특히 사실입니다. 우리의 목적은 면역 질병 1 형 당뇨병 1,3,4,5 인간의 T 세포에 의해 인식 항원을 조사하는 것입니다. T 세포에 의해 인식 항원이 발견되지 않는 조직에 대한 인간 T-세포 반응을 분석하기 위해 우리는 기능 assays 6 호환되는 형식으로 인간의 조직에서 단백질 항원을 추출하는 방법을 개발했습니다. 추출 방법은 인간의 말초 혈액 mononuclear 세포에 독성했다 세제를 포함하는 lysate를 얻을 수 있기 때문에 unpurified 조직 추출물로 이전, T-세포 반응을 측정 할 수 없습니다. 여기 인간의 T 세포에 독성이없는 형식으로 인간의 조직에서 단백질을 추출하기위한 프로토콜을 설명합니다. 조직은 butan-1-안녕, 아세토 니트릴 및 와트의 혼합물에 균질하고 있습니다어 (BAW). 조직 추출물의 단백질 농도는 측정 및 단백질의 알려진 질량은 튜브에 aliquoted 있습니다. 추출 후, 유기 용제는 lyophilization에 의해 제거됩니다. 필요 할 때까지 동결 건조 된 조직 추출물은 저장 될 수 있습니다. 면역 기능, 면역 세포의 정지 assays에 사용하기 위해, 적절한 문화 미디어, 동결 건조 추출물에 직접 추가 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 준비 추출물에 대한 응답으로 PBMC의 시토 킨 생산 및 확산은, 쉽게 측정 하였다. 따라서, 우리의 방법은 T-세포 반응의 분석에서 항원의 소스로 사용할 수있는 인간의 조직 lysates의 급속한 준비를 할 수 있습니다. 이 방법은 이식, 암과 autoimmunity의 조직에 적응 면역 반응의 분석을 용이하게 할 것을 권장합니다.
Protocol
Discussion
우리는 이러한 세제 등 독성 화학 물질에서 자유를 인간의 조직에서 추출을 생성 싶었 기 때문이 프로토콜은 개발되었습니다. 특히 우리는 체외에서 인간의 면역 기능의 assays에서 사용할 수있는 인체 조직의 추출물을 준비하는 데 사용했습니다. 이 프로토콜을 사용하여 준비 추출물은 똑같이 버퍼에 재구성 및 blotting 서쪽이나 액체 크로마토 그래피 등 여러 생화학 분석, 사용할 수 있습니…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 호주 국립 보건 의학 연구위원회 (NHMRC # 559007) 및 아동 당뇨병 연구 재단 (JDRF 4-2006-1025)와 빅토리아 정부의 운영 인프라 계획의 보조금에 의해 지원됩니다. 우리는 인간의 조직을 제공하는 톰 Mandel 작은 섬 이식 프로그램 작은 섬 절연 팀의 구성원을 감사드립니다. 인간의 조직이 지역의 윤리적 승인을 수집하여 사용되었다 (세인트 빈센트 병원 HREC-A 011 / 04, 세인트 빈센트의 건강 HREC-A 135 / 08).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
Riferimenti
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