Extractie van Tissue Antigens voor functionele testen
Summary
Een eenvoudige protocol voor het bereiden van extracten van menselijke weefsels worden gebruikt als bron van antigenen in functionele T-cel-assays beschreven. Deze methode laat T-cel responsen op weefsel afgeleide antigenen te meten<em> In vitro</em>.
Abstract
Veel antigen doelstellingen van adaptieve immuunrespons, die door B en T cellen, niet gedefinieerd 1. Dit geldt met name voor auto-immuunziekten en kanker 2. Ons doel is het onderzoeken van de antigenen herkend door menselijke T-cellen in de autoimmuunziekte type 1 diabetes 1,3,4,5. De menselijke T-cel responsen te analyseren tegen weefsel waar de antigenen herkend door T cellen worden geïdentificeerd we een methode ontwikkeld om eiwitantigenen onttrekken menselijk weefsel in een formaat dat compatibel is met functionele assays 6. Voorheen T-cel responsen op ongezuiverde weefselextracten kon niet gemeten worden omdat de extractiemethoden opleveren lysaat vervat detergentia die toxisch voor menselijke perifere mononucleaire bloedcellen. Hier beschrijven we een protocol voor het extraheren van eiwitten uit menselijk weefsel in een formaat dat niet toxisch is voor humane T-cellen. Het weefsel wordt gehomogeniseerd in een mengsel van butaan-1-ol, acetonitril en water (BAW). De eiwitconcentratie in het weefsel extract wordt gemeten en een bekende massa eiwit verdeeld in buizen. Na extractie wordt de organische oplosmiddelen verwijderd door lyofilisatie. Gevriesdroogd weefselextracten kan worden opgeslagen tot zij nodig zijn. Voor gebruik in assays van de immuunfunctie, een suspensie van immuuncellen, in geschikte kweekmedia, direct kan worden toegevoegd om het gevriesdroogde extract. Cytokineproductie en proliferatie van PBMC als reactie op extracten bereid met deze methode, werden gemakkelijk gemeten. Vandaar onze werkwijze maakt de snelle bereiding van menselijk weefsel lysaten die kunnen worden gebruikt als bron van antigenen in de analyse van T-cel responsen. We suggereren dat deze methode de analyse van adaptieve immuunrespons vergemakkelijken weefsel bij transplantatie, kanker en auto-immuniteit.
Protocol
Discussion
Dit protocol is ontwikkeld, omdat we wilden een uittreksel uit menselijk weefsel dat was vrij van giftige chemicaliën zoals wasmiddelen te genereren. Specifiek hebben we gebruikt om extracten van humane weefsels die kunnen worden gebruikt in assays van menselijke immuunsysteem in vitro bereiden. Extracten bereid met dit protocol kan ook worden opgelost in een buffer en voor vele biochemische analyses, zoals Western blotting of vloeistofchromatografie. Dit maakt deze techniek voor vele verdere toepassingen. </p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559007) en de Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) en de operationele infrastructuur Regeling van de Victoriaanse regering. Wij danken de leden van de Tom Mandel Islet Transplantation Programma Islet Isolatie Team voor het verstrekken van de menselijke weefsels. Menselijke weefsels werden verzameld en gebruikt met de lokale ethische goedkeuring (St. Vincent's Hospital HREC-A 011/04 en St. Vincent's Health HREC-A 135/08).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
Riferimenti
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation. J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).
- Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes. Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).
- Mannering, S. I. The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).
- Mannering, S. I. The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified. J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).
- Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays. Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).
- Mannering, S. I. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).
- Mannering, S. I. CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).
- Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide. Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).
- Peakman, M. Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes. Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).
- Honey, K., Rudensky, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).
