ऊतक प्रतिजनों के कार्यात्मक assays के लिए निकासी
Summary
मानव ऊतक के निष्कर्षों के लिए कार्यात्मक टी सेल assays में एंटीजन का एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा तैयार करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल में वर्णित है. इस विधि ऊतक व्युत्पन्न प्रतिजनों के लिए टी सेल प्रतिक्रिया मापा जा करने की अनुमति देता है<em> इन विट्रो में</em>.
Abstract
अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रतिजन लक्ष्य, बी और टी कोशिकाओं द्वारा मान्यता प्राप्त है, के कई 1 परिभाषित नहीं किया गया है. यह autoimmune रोग और कैंसर 2 में विशेष रूप से सच है. हमारा उद्देश्य autoimmune रोग प्रकार 1 मधुमेह 1,3,4,5 में मानव टी कोशिकाओं द्वारा मान्यता प्राप्त प्रतिजनों की जांच करने के लिए है. ऊतक जहां प्रतिजनों टी कोशिकाओं द्वारा मान्यता प्राप्त नहीं की पहचान कर रहे हैं के खिलाफ मानव टी सेल प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए हम एक प्रारूप कि कार्यात्मक 6 assays के साथ संगत है में मानव ऊतकों से प्रोटीन प्रतिजनों को निकालने के लिए एक विधि विकसित की है. Unpurified ऊतक के अर्क के लिए पहले, टी सेल प्रतिक्रिया क्योंकि निष्कर्षण तरीकों एक lysate कि डिटर्जेंट कि मानव परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं को विषाक्त थे निहित उपज नहीं मापा जा सकता है. यहाँ हम एक स्वरूप है कि मानव टी कोशिकाओं को विषाक्त नहीं है में मानव ऊतकों से प्रोटीन निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. ऊतक Butan-1-राजभाषा acetonitrile, और वाट के एक मिश्रण में homogenized हैएर (Baw). ऊतक निकालने में प्रोटीन एकाग्रता मापा जाता है और प्रोटीन का एक ज्ञात ट्यूबों में बड़े पैमाने पर aliquoted है. निकासी के बाद, कार्बनिक सॉल्वैंट्स lyophilization से हटा रहे हैं. Lyophilized ऊतक के अर्क जब तक आवश्यक संग्रहीत किया जा सकता है. प्रतिरक्षा समारोह, प्रतिरक्षा कोशिकाओं का एक निलंबन assays में उपयोग के लिए उपयुक्त संस्कृति मीडिया में, lyophilized निकालने के लिए किया जा सीधे जोड़ा जा सकता है. Cytokine उत्पादन और PBMC द्वारा प्रसार, इस पद्धति का उपयोग करके तैयार अर्क के जवाब में, आसानी से मापा गया. इसलिए, हमारे विधि मानव ऊतकों lysates कि टी सेल प्रतिक्रिया के विश्लेषण में प्रतिजनों के स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है तेजी से तैयारी की अनुमति देता है. हमारा सुझाव है कि इस विधि प्रत्यारोपण, कैंसर और autoimmunity में ऊतकों को अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विश्लेषण की सुविधा होगी.
Protocol
Discussion
इस प्रोटोकॉल विकसित किया गया था, क्योंकि हम एक मानव ऊतकों कि डिटर्जेंट जैसे जहरीले रसायनों से मुक्त किया गया था से निकालने उत्पन्न करना चाहता था. विशेष रूप से हम इसे इस्तेमाल किया है मानव ऊतक के निष्कर?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (NHMRC 559,007) और किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन (4-2006-1025 JDRF) और विक्टोरियन सरकार का परिचालन इन्फ्रास्ट्रक्चर योजना से अनुदान द्वारा समर्थित है. हम मानव ऊतकों प्रदान करने के लिए टॉम मेंडल आइलेट प्रत्यारोपण कार्यक्रम आइलेट अलगाव टीम के सदस्यों को धन्यवाद. मानव ऊतकों एकत्र थे और स्थानीय नैतिक अनुमोदन के साथ इस्तेमाल किया (सेंट विन्सेंट अस्पताल HREC ए / 04 011 और सेंट विन्सेंट स्वास्थ्य HREC – 135/08).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
Riferimenti
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation. J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).
- Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes. Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).
- Mannering, S. I. The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).
- Mannering, S. I. The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified. J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).
- Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays. Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).
- Mannering, S. I. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).
- Mannering, S. I. CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).
- Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide. Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).
- Peakman, M. Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes. Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).
- Honey, K., Rudensky, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).
