Un semplice protocollo per la preparazione di estratti di tessuto umano da utilizzare come fonte di antigeni a cellule T funzionali saggi è descritto. Questo metodo consente risposte delle cellule T al tessuto-antigeni derivati da misurare In vitro.
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Articolo metodologico
Estrazione di antigeni dei tessuti per test funzionali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molti degli obiettivi di antigene risposta immunitaria adattativa, riconosciuti da cellule T e B, non sono stati definiti 1. Ciò è particolarmente vero per le malattie autoimmuni e il cancro 2. Il nostro obiettivo è quello di studiare gli antigeni riconosciuti dalle cellule T nel tipo di malattia autoimmune 1 diabete 1,3,4,5. Per analizzare umani risposte delle cellule T contro il tessuto in cui gli antigeni riconosciuti da cellule T non sono identificati abbiamo sviluppato un metodo per estrarre antigeni proteici da tessuto umano in un formato compatibile con saggi funzionali 6. Risposte precedentemente, cellule T ad estratti di tessuto non purificati non potevano essere misurati perché i metodi di estrazione produrre un lisato che conteneva detergenti tossiche per cellule mononucleari del sangue periferico. Qui si descrive un protocollo per estrarre proteine da tessuti umani in un formato che non è tossico per le cellule T umane. Il tessuto è omogeneizzato in una miscela di butan-1-olo, acetonitrile e water (BAW). La concentrazione proteica nel tessuto estratto viene misurato e una massa nota di proteina è frazionato in provette. Dopo l'estrazione, i solventi organici vengono rimossi mediante liofilizzazione. Estratti di tessuti liofilizzati possono essere memorizzati fino al momento. Per l'uso in saggi di funzione immunitaria, una sospensione di cellule del sistema immunitario, in terreni di coltura appropriati, possono essere aggiunti direttamente al estratto liofilizzato. Proliferazione e produzione di citochine da PBMC, in risposta a estratti preparati utilizzando questo metodo, sono stati facilmente misurata. Quindi, il nostro metodo permette la rapida preparazione di lisati di tessuto umano che possono essere utilizzati come fonte di antigeni nell'analisi delle risposte delle cellule T. Suggeriamo che questo metodo faciliterà l'analisi delle risposte immunitarie adattative ai tessuti nei trapianti, cancro e malattie autoimmuni.
Protocollo
1. Preparazione del tessuto Spleen
- Nota-tutto il materiale umana dovrebbero essere considerati come potenzialmente infettivi e le procedure devono essere condotte in una cabina a flusso laminare di classe II. Utilizzando forbici sterili e pinze, rimuovere il tessuto grasso e fibroso dalle sezioni milza (~ 1-2 cm di dimensione) e tagliare la maggior quantità di materiale capsula esterna possibile.
- Tagliare un pezzo di piccole dimensioni (1-2 cm 3) del tessuto della milza e posizionare ogni pezzo in una sterile tubo da 50 ml Falcon.
- Snap-congelare i pezzi di tessuto per immersione in liquido N 2.
- Conservare....
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Discussione
Questo protocollo è stato sviluppato perché volevamo per generare un estratto dal tessuto umano che è stato esente da sostanze chimiche tossiche come i detersivi. Specificamente abbiamo utilizzato per preparare estratti di tessuto umano che possono essere utilizzati in saggi di funzione immunitaria umana in vitro. Estratti preparati usando questo protocollo può ugualmente essere ricostituito in qualsiasi buffer e usato per molte analisi biochimiche, quali la cromatografia in western blotting o liquido. Ciò rend.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato da sovvenzioni dal Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559007) e la Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) e il progetto di infrastruttura operativa del Governo del Victoria. Ringraziamo i membri del Team Tom Mandel Islet Programma di trapianto di isole di isolamento per fornire i tessuti umani. I tessuti umani sono stati raccolti ed utilizzati con il locale approvazione etica (St. Vincent Hospital HREC-A 011/04 e Salute San Vincenzo HREC-A 135/08).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| 5 ml 12 provette da 75 mm di polistirene sterili | BD Falcon | 352054 | |
| Tappi per provette di polistirene tubi (di cui sopra) | BD Falcon | 352032 | |
| Provette sterili da 50 ml | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chimica | 2856-10 | |
| Butan-1-olo | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Omogeneizzatore: PRO200 | Bio-strategia | 01-01200 | 10 x 115 mm a dente di sega generatore |
| Liofilizzatore | Virtis, da banco 4K | ||
| Sterile aghi calibro 18-20 | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Media | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 |
Tabella 1. Reagenti e attrezzature specifiche.
Riferimenti
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identificat....
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Ristampe e permessi
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