Monitoreo de células autónomas Ritmos reloj circadiano de expresión génica utilizando luciferase reporteros Bioluminiscencia
Summary
Los relojes circadianos funcionar dentro de las células individuales, es decir, son células autónomas. A continuación, se describen los métodos para la generación de células autónomas modelos de reloj de forma no invasiva, luciferasa tiempo real basado en la tecnología de bioluminiscencia. Células Reporter proporcionar sistemas manejables, modelo funcional para el estudio de la biología circadiana.
Abstract
En los mamíferos, muchos aspectos del comportamiento y la fisiología como los ciclos de sueño-vigilia y el metabolismo del hígado son regulados por relojes circadianos endógenos (revisado 1,2). El tiempo circadiano de mantenimiento de sistema es una estructura jerárquica multi-oscilador red, con el reloj central situado en el núcleo supraquiasmático (SCN) sincronizar y coordinar los relojes extra-SCN y periférico en otra parte 1,2. Las células individuales son las unidades funcionales para la generación y el mantenimiento de los ritmos circadianos 3,4, y estos osciladores de diferentes tipos de tejidos en el organismo una proporción notablemente similar mecanismo bioquímico de retroalimentación negativa. Sin embargo, debido a las interacciones a nivel de red neuronal en el SNC y por medio de señales rítmicas, sistémicas a nivel de organismos, de los ritmos circadianos en el nivel organismal no necesariamente son células autónomas de 5-7. En comparación con los estudios tradicionales de actividad locomotora in vivo y ex vivo explantes SCN, Cell-basado en los ensayos in vitro permiten el descubrimiento de células autónomas defectos circadianos 5,8. Estratégicamente, modelos basados en células son más experimentalmente tratable para la caracterización fenotípica y rápido descubrimiento de los mecanismos de reloj básicas 5,8-13.
Debido a que los ritmos circadianos son dinámicas, las mediciones longitudinales con alta resolución temporal son necesarios para evaluar la función del reloj. En los últimos años, grabación en tiempo real utilizando bioluminiscencia luciferasa de luciérnaga como reportero se ha convertido en una técnica común para el estudio de los ritmos circadianos en mamíferos 14,15, ya que permite el examen de la persistencia y la dinámica de los ritmos moleculares. Para supervisar células autónomas ritmos circadianos de la expresión génica, luciferase reporteros se pueden introducir en las células a través de la transfección transitoria 13,16,17 o transducción estable 5,10,18,19. Aquí se describe un protocolo de transducción estable utilizando lentivirus mediada por la entrega de genes. Tsistema de vector lentiviral que es superior a los métodos tradicionales tales como la transfección transitoria y transmisión de línea germinal debido a su eficiencia y versatilidad: permite una entrega eficaz y la integración estable en el genoma huésped de tanto que se dividen y no se dividen las células 20. Una vez que una línea celular reportera se ha establecido, la dinámica de la función de reloj se pueden examinar a través de grabación de bioluminiscencia. En primer lugar, describimos la generación de P (Per2)-D líneas Luc reportero, y luego se presentan datos de este y otros reporteros circadianos. En estos ensayos, los fibroblastos 3T3 de ratón y células de osteosarcoma humano U2OS se utilizan como modelos celulares. También se discuten las diversas formas de utilizar estos modelos en estudios reloj circadiano. Los métodos descritos aquí se pueden aplicar a una gran variedad de tipos de células para estudiar la base molecular y celular de los relojes circadianos, y puede resultar útil en la lucha contra los problemas en otros sistemas biológicos.
Protocol
Discussion
1. Modificaciones al Protocolo actual
1.1 Los dispositivos de grabación y consideraciones de rendimiento
Debido a su disponibilidad comercial, la LumiCycle (Actimetrics) se ha convertido en el dispositivo más utilizado luminómetro automatizado para grabación en tiempo real 4,5,9,19,29-31. El LumiCycle emplea tubos fotomultiplicadores (PMT) como detectores de luz, que proporcionan una sensibilidad extremadamente alta y bajo ruido 14, y por lo …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Nacional de Ciencia (IOS-0920417) (ACL).
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243FS | For regular cell growth |
| DMEM | Invitrogen | 12100-046 | For luminometry |
| FBS | HyClone | SH3091003 | |
| Pen/Strep/Gln(100x) | HyClone | SV3008201 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| D-Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| All other chemicals | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Tissue culture incubator | 5% CO2 at 37°C | ||
| Tissue culture hood | BSL-2 certified | ||
| Light & fluorescent microscope | Phase contrast optional | ||
| LumiCycle | Actimetrics |
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