Studerer proteolyse av Cyclin B på Single Cell nivå i hele cellepopulasjoner
Summary
Metafase å anaphase overgang utløses gjennom anaphase-fremme kompleks (APC / C)-avhengig ubiquitinering og påfølgende ødeleggelse av cyclin B. Her har vi etablert et system som etter puls-chase merking, tillater overvåking cyclin B proteolyse i hele cellepopulasjoner og forenkler påvisning av forstyrrelse fra mitotiske sjekkpunkt.
Abstract
Jevn fordeling av kromosomene mellom de to dattercellene ved celledeling er en forutsetning for å garantere genetisk stabilitet 1. Unøyaktigheter under kromosom separasjon er et kjennetegn på malignitet og assosiert med progressiv sykdom 2-4. Spindelen forsamlingen sjekkpunkt (SAC) er en mitotisk overvåking mekanisme som holder tilbake cellene ved metafase til hver enkelt kromosom har etablert en stabil bipolar vedlegg til mitotisk spindel en. SAC utøver sin funksjon ved forstyrrelser med aktiverende APC / C subenhet Cdc20 å blokkere proteolyse av securin og cyclin B og dermed kromosom separasjon og mitotisk exit. Feil montering av kromosomer hindrer stanse SAC signalering og forårsaker fortsatt hemming av APC / C Cdc20 til problemet er løst, for å unngå kromosom missegregation, Aneuploidy og ondartede vekster en.
De fleste studier som er adressert til jegnfluence av feil kromosomal feste på APC / C-avhengige proteolyse tok fordel av spindel avbrudd med depolymerizing eller microtubule-stabiliserende medikamenter for å forstyrre kromosomal vedlegg til mikrotubuli. Siden forstyrrelser microtubule kinetikk kan påvirke transport og lokalisering av kritiske regulatorer, disse prosedyrene bære en risiko for å indusere kunstige effekter 5.
Å studere hvordan SAC forstyrrer APC / C-avhengige proteolyse av cyclin B under mitose i uaffisert cellepopulasjoner, etablerte vi en histone H2-GFP-basert system som tillot samtidig overvåking av metafase justering av mitotiske kromosomer og proteolyse av cyclin B 6 .
Å skildre proteolytiske profiler genererte vi et kimært cyclin B reporter molekyl med en C-terminal SNAP moiety 6 (figur 1). I en selv-merking omsetningen er den SNAP-moiety stand til å danne kovalente bindinger medalkylguanine-bærere (SNAP substrat) 7,8 (figur 1). SNAP substratmolekyler er lett tilgjengelig og har et bredt spekter av forskjellige fluorokromer. Kimære cyclin B-SNAP molekyler blir merket ved tilsetning av den membran-gjennomtrengelige SNAP substrat til vekstmediet 7 (figur 1). Etter merking reaksjonen synker cyclin B-SNAP fluorescensintensitet i et puls-chase reaksjon-aktig måte og fluorescensintensiteter reflekterer nivåene av cyclin B degradering 6 (figur 1). Vårt system forenkler overvåking av mitotiske APC / C-avhengig proteolyse i et stort antall celler (eller flere cellepopulasjoner) i parallell. Dermed kan systemet være et verdifullt verktøy for å identifisere agenter / små molekyler som er i stand til å forstyrre proteolytisk aktivitet på metafase å anaphase overgang. Videre har som syntese av cyclin B under mitose nylig blitt foreslått som en viktig mechanism for å fremme en mitotisk blokk i mus og mennesker ved å holde cyclin B uttrykk nivåer stabil 9,10, aktivert dette systemet å analysere cyclin B proteolyse som en del av et balansert likevekt 6.
Protocol
Discussion
Vi presenterer her en live-cell imaging tilnærming tilrettelegge samtidig overvåking av cyclin B proteolyse og kromosom justering. Denne fremgangsmåten gjør at studiet av mitotiske kontroll i uaffisert cellepopulasjoner på enkelt celle-nivå. Cyclin B degraderingsprodukter kurver rette direkte innsikt i aktiviteten av APC / C og dermed indirekte avspeile statusen av SAC 6.
Denne tilnærmingen, selv om etableres basert på Skann ^ R programvare, kan lett reproduseres på ethve…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for S. Taylor for å gi pLPCX-Histone H2-GFP plasmid. Vi takker R. Mertelsmann for kontinuerlig støtte. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
| Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
| Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
| SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
| Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
| μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
| Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
| Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
| Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
Riferimenti
- Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).
- Nasmyth, K. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science. 297, 559-565 (2002).
- Cahill, D. P. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature. 392, 300-303 (1998).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instabilities in human cancers. Nature. 396, 643-649 (1998).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-4892 (2010).
- Schnerch, D. Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations. Cell Cycle. 11, (2012).
- Keppler, A. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).
- Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).
- Malureanu, L. Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis. J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).
- Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1. PLoS One. 5, (2010).
- Wolthuis, R. Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin. A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).
