دراسة التحلل البروتيني B من السيكلين على مستوى خلية واحدة في الجامعة السكان الخلية
Summary
الطورية إلى طور الصعود يتم تشغيل من خلال الانتقال طور الصعود تعزيز والمعقدة (APC / C) التي تعتمد على ubiquitination والتدمير اللاحق للB. السيكلين هنا، أنشأنا نظاما، وبعد مطاردة نبض وضع العلامات، ويسمح برصد السيكلين B التحلل البروتيني في الخلية بأكملها السكان يسهل الكشف عن تدخل من قبل نقطة تفتيش تابعة للالإنقسامية.
Abstract
التوزيع المتساوي للصبغيات بين اثنين من الخلايا الوليدة أثناء انقسام الخلية هو شرط أساسي لضمان الاستقرار الجيني 1. أخطاء أثناء فصل كروموسوم هي السمة المميزة للخباثة والمرتبطة بأمراض التدريجي 2-4. حاجز الجمعية المغزل (SAC) هي آلية المراقبة الإنقسامية أن يعيق الخلايا في الطورية حتى كل كروموسوم واحد أنشأت مرفق ثنائي القطب مستقرة إلى المغزل التفتلي 1. وتمارس وظيفتها SAC من التدخل في تفعيل APC / C الوحيدات Cdc20 لمنع التحلل البروتيني من securin وB السيكلين وبالتالي فصل كروموسوم والخروج الإنقسامية. المرفقات غير لائق من الكروموسومات يمنع إسكات الإشارة ويسبب تثبيط SAC استمرت من APC / C Cdc20 حتى يتم حل المشكلة لتجنب missegregation كروموسوم، وعدم توازن الصبغيات زوائد الخبيثة 1.
معظم الدراسات التي تناولت طاستغرق nfluence من المرفقات غير لائق على الكروموسومات APC / C التي تعتمد على التحلل البروتيني الاستفادة من تعطيل أو المغزل باستخدام depolymerizing أنيبيب استقرار المخدرات للتدخل في المرفقات الكروموسومات لميكروتثبول. منذ التدخل في حركية أنيبيب يمكن أن تؤثر على النقل والترجمة من المنظمين الحرجة، هذه الإجراءات تحمل خطر إحداث تأثيرات مصطنعة 5.
أنشأنا لدراسة كيفية SAC يتداخل مع APC / C التي تعتمد على التحلل البروتيني B من خلال السيكلين الانقسام في الخلية رابط الجأش السكان، وهو نظام هيستون H2-GFP-يعتمد الامر الذي اتاح للرصد في وقت واحد من الكروموسومات الطورية المحاذاة الإنقسامية والتحلل البروتيني B من 6 السيكلين .
لتصوير ملامح بروتين، ولدت لدينا B السيكلين خيالية جزيء مراسل مع شاردة SNAP C-محطة 6 (الشكل 1). في رد فعل ذاتي وضع العلامات، وSNAP-شاردة قادرة على تشكيل روابط تساهمية معalkylguanine-ناقلات (الركيزة SNAP) 7،8 (الشكل 1). جزيئات الركيزة SNAP متوفرة بسهولة وتحمل مجموعة واسعة من fluorochromes مختلفة. السيكلين خيالية B-SNAP الجزيئات تصبح المسمى عند إضافة الركيزة SNAP-نفاذية الغشاء إلى النمو المتوسط 7 (الشكل 1). بعد رد الفعل وضع العلامات، وكثافة السيكلين B-SNAP مضان انخفاض في رد فعل يشبه نبض مطاردة بطريقة وشدة مضان تعكس مستويات السيكلين B تدهور 6 (الشكل 1). نظامنا يسهل رصد التحلل البروتيني APC / C التي تعتمد على الإنقسامية في أعداد كبيرة من الخلايا (أو خلية السكان عدة) في نفس الوقت. وبالتالي، قد يكون النظام أداة قيمة لتحديد وكلاء / الجزيئات الصغيرة التي تكون قادرة على التدخل في النشاط بروتين في طور الصعود إلى الطورية الانتقالية. وعلاوة على ذلك، وتوليف B السيكلين خلال الانقسام وقد تم مؤخرا كما اقترح على أهمية mechanisم في تعزيز كتلة الإنقسامية في الفئران والبشر عن طريق الحفاظ على مستويات مستقرة السيكلين التعبير B 9،10، تمكين هذا النظام لنا لتحليل السيكلين التحلل البروتيني B وعنصر واحد من توازن متوازنة 6.
Protocol
Discussion
نقدم هنا نهج الخلية الحية التصوير القائم على تيسير رصد في وقت واحد من التحلل البروتيني B السيكلين والمواءمة كروموسوم. هذا النهج يتيح للدراسة في السيطرة الإنقسامية رابط الجأش السكان الخلية على مستوى خلية واحدة. منحنيات السيكلين تدهور B تسهيل رؤى مباشرة في نشاط APC / C وب?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لتايلور S. لتوفير pLPCX-H2-هيستون GFP البلازميد. نشكر R. Mertelsmann للدعم المستمر. وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
| Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
| Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
| SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
| Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
| μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
| Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
| Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
| Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
Riferimenti
- Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).
- Nasmyth, K. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science. 297, 559-565 (2002).
- Cahill, D. P. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature. 392, 300-303 (1998).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instabilities in human cancers. Nature. 396, 643-649 (1998).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-4892 (2010).
- Schnerch, D. Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations. Cell Cycle. 11, (2012).
- Keppler, A. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).
- Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).
- Malureanu, L. Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis. J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).
- Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1. PLoS One. 5, (2010).
- Wolthuis, R. Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin. A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).
